DiI染料标记示踪子宫上皮细胞来源外泌体的方法技术

本发明专利技术目的是提供一种不改变外泌体结构和组成成分，不影响外泌体生物功能的利用DiI染料标记、示踪子宫上皮细胞来源外泌体的方法。所述方法包括：将外泌体加入10～30nM的DiI染料中37℃孵育30min后，离心，去除多余的染料，所得外泌体用PBS重悬，得到标记后的外泌体。本发明专利技术的有益效果主要体现在：本发明专利技术标记方法改变外泌体结构和组成成分，不影响外泌体生物功能，可对胚胎滋养层细胞摄取子宫上皮细胞来源外泌体过程进行准确示踪，有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。

A method of tracing exosomes derived from uterine epithelial cells with DiI dye

【技术实现步骤摘要】
DiI染料标记示踪子宫上皮细胞来源外泌体的方法(一)
本专利技术涉及DiI染料标记、示踪子宫上皮细胞来源外泌体的方法。(二)
技术介绍
DiI即DiIC18(3)，全称为1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanineperchlorate，分子式为C59H97ClN2O4(结构如式(I)所示)，分子量为933.88，CASnumber为41085-99-8。DiI可以溶解于无水乙醇、DMSO和DMF，其中在DMSO中的溶解度大于10mg/ml。是最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现橙红色荧光。DiI是一种亲脂性膜染料，进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色，DiI和磷酯双层膜结合后的激发光谱和发射光谱参见图1。DiI在进入细胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。DiI被激发后可以发出橙红色的荧光，最大激发波长为549nm，最大发射波长为565nm。试剂4℃避光保存，一年有效。配制的储存液-20℃避光保存，半年有效。胞外囊泡(Extracellularvesicles，Evs)是由细胞产生的，分泌到细胞外部的发挥细胞通讯作用的脂质双分子层结构。根据囊泡直径大小，分为外泌体、微泡和凋亡小体。外泌体直径约为40～200nm，是一种重要的细胞远端通讯的方式，几乎所有类型的细胞都能够分泌产生外泌体，包括癌细胞、上皮细胞、脂肪细胞等。在生物体液中，也鉴定发现了外泌体，例如血液、尿液、脑脊液等。外泌体之所以具有重要的细胞通讯作用，是因为外泌体中包装有大量宿主细胞来源的分子，例如蛋白质、mRNA/miRNA和DNA等物质。随着细胞生物学和医学前沿交叉领域的不断发展，外泌体的研究逐渐深入，越来越多的研究证明外泌体在疾病治疗中展现出令人振奋的治疗效果。但在利用外泌体进行治疗前，首先要阐明外泌体在体内的生物分布和在细胞中的最终命运。所以迫切需要一种标记方法实现对外泌体体外标记和活体示踪，从而实现在不影响其功能的前提下可视化外泌体，有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。目前为止已有多种标记外泌体的方法，但是都存在一定的缺陷，主要表现在破坏外泌体的膜结构、改变外泌体的组成成分、影响外泌体的功能等。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种不改变外泌体结构和组成成分，不影响外泌体生物功能的利用DiI染料标记、示踪子宫上皮细胞来源外泌体的方法。本专利技术采用的技术方案是：DiI染料标记外泌体的方法，所述方法包括：将外泌体加入10～30nM的DiI染料中37℃孵育30min后，离心，去除多余的染料，沉淀外泌体，所得外泌体用PBS重悬，得到标记后的外泌体；所述外泌体与DiI染料质量用量之比为：40～60:1。优选的，所述外泌体为子宫上皮细胞(如Ishikawa细胞或HEC-1-A细胞等)来源的外泌体。本专利技术还涉及一种利用所述DiI染料标记外泌体，对胚胎滋养层细胞摄取子宫上皮细胞来源外泌体过程进行示踪的方法，所述方法包括：(1)将子宫上皮细胞来源外泌体与10～30nM的DiI染料37℃孵育30min；(2)离心，去除多余的染料，沉淀外泌体，所得外泌体用PBS重悬，加入胚胎滋养层细胞中，37℃培养4～6h；(3)取出细胞培养板，用PBS清洗多次，加入多聚甲醛固定细胞；(4)加入PBST做细胞通透性处理；(5)去除PBST，用PBS清洗多次；(6)加入phallioidin-FITC，染细胞骨架；(7)用免疫染色洗涤液去除染料；(8)加入DAPI染液孵育5min，用PBS清洗细胞多次；(9)荧光显微镜观察。优选的，所述子宫上皮细胞为Ishikawa细胞或HEC-1-A细胞。优选的，所述胚胎滋养层细胞为HTR8/SVneo细胞。具体的，所述免疫染色洗涤液为浓度0.1M、含1％BSA的PBS。本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术标记方法不改变外泌体结构和组成成分，不影响外泌体生物功能，可对胚胎滋养层细胞摄取子宫上皮细胞来源外泌体过程进行准确示踪，有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。(四)附图说明图1为DiI和磷酯双层膜结合后的激发光谱和发射光谱；图2为Ishikawa细胞系(A)、HEC-1-A细胞系(B)、HTR8/SVneo细胞系(C)的正常形态(普通光学显微镜，10×)；图3为HTR8/SVneo对Ishikawa细胞分泌外泌体(A)和HEC-1-A细胞分泌外泌体(B)的摄取；图中(ae)为DiI染色的外泌体，(bf)为细胞骨架，(cg)为细胞核，(dh)为组合图，外泌体在细胞中的定位。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1：实验步骤：1、ishikawa(来源于中科院上海细胞库)、HEC-1-A(中科院上海细胞库)上清中采用超速离心的方法提取外泌体，简单说明如下：150ml上清300g离心10min，2000g20min，10000g、30min，所得上清过0.22um滤膜，120000g离心两次，以上离心都在4℃下进行，共获得约80ug外泌体，与20uM的DiI染料(60ul)37℃孵育30min；2、120000g4℃离心70min，去除多余的染料，沉淀外泌体，所得外泌体用200ulPBS重悬，上清(即单独加入DiI染料)作为对照，加入1％血清培养基的HTR8细胞中，37℃培养4～6h；3、取出细胞培养板，用PBS清洗3遍，每次3min；4、加入4％多聚甲醛(PFA)固定细胞，固定液覆盖细胞表面、即可，固定20min；5、加入PBST(PBS+0.05％Triton-X100)，覆盖细胞表面，做细胞通透性处理20min；6、去除PBST，用PBS清洗3遍，每次3min；7、加入phallioidin-FITC(用免疫荧光二抗稀释液稀释比例1：100)200ul，50min，染细胞骨架；8、用免疫染色洗涤液(PBS+1％BSA)去除染料，洗3遍每次3min；9、加入DAPI染液(5mg/ml)孵育5min，用PBS清洗细胞3遍，每次3min；10、荧光显微镜观察。实验结果：Ishikawa细胞系(A)、HEC-1-A细胞系(B)、HTR8/SVneo细胞系(C)的正常形态参见图2，HTR8/SVneo对Ishikawa细胞分泌外泌体(A)和HEC-1-A细胞分泌外泌体(B)的摄取过程结果参见图3，结果表明，相对于对照组，实验组滋养层细胞内部出现红色荧光，而单独加入DiI染料超离后的对照组没有出现红色荧光，说明红色荧光标记的ishikawa和HEC-1-A来源的外泌体被HTR8/SVneo细胞摄取(phalliodin-FITC标记的绿色细胞骨架，DAPI标记蓝色细胞核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.DiI染料标记外泌体的方法，所述方法包括：将外泌体加入10～30nM的DiI染料中37℃孵育30min后，离心，去除多余的染料，沉淀外泌体，所得外泌体用PBS重悬，得到标记后的外泌体；所述外泌体与DiI染料质量用量之比为：40～60:1。/n

【技术特征摘要】
1.DiI染料标记外泌体的方法，所述方法包括：将外泌体加入10～30nM的DiI染料中37℃孵育30min后，离心，去除多余的染料，沉淀外泌体，所得外泌体用PBS重悬，得到标记后的外泌体；所述外泌体与DiI染料质量用量之比为：40～60:1。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述外泌体为子宫上皮细胞来源的外泌体。


3.利用权利要求1所述DiI染料标记外泌体，对胚胎滋养层细胞摄取子宫上皮细胞来源外泌体过程进行示踪的方法，所述方法包括：
(1)将子宫上皮细胞来源外泌体与10～30nM的DiI染料37℃孵育30min；
(2)离心，去除多余的染料，沉淀外泌体，所得外泌体用PBS重悬，加入胚胎滋养层细胞中，37℃培养4～6h；
...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭强，施爽，褚玲娜，邱寒峰，王争光，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33