一种肿瘤细胞来源外泌体抗原在DC疫苗中的应用方法技术

本发明专利技术公开了一种肿瘤细胞来源外泌体抗原在DC疫苗中的应用方法。本发明专利技术保护一种肿瘤疫苗的制备方法，包括如下步骤：采用肿瘤细胞外泌体致敏DC细胞，得到所述肿瘤疫苗。本发明专利技术提供的肿瘤细胞上清外泌体具有稳定性良好，毒性低，细胞相容性好，便于操作和临床肿瘤免疫治疗应用和推广，是一项简单易行实用的应用技术和方法。解决了现有的DC疫苗构建中抗原来源缺乏，相容性差，不稳定性，以及外援DC抗原载体具有生物毒性，难操作等问题。

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤细胞来源外泌体抗原在DC疫苗中的应用方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种肿瘤细胞来源外泌体抗原在DC疫苗中的应用方法。
技术介绍
众所周知，恶性肿瘤是严重危胁人类健康的首要原因，发展高效低副作用的治疗模式对提高患者的生存率和生活质量至关重要。近十年来，尽管抗肿瘤药物治疗的特异性和安全性大大提高，然而肿瘤侵袭、转移、复发，以及病人对常规药物治疗产生抗药性仍然是肿瘤无法得到有效控制的根源，因此如何在机体内引发持久的抗肿瘤作用，避免治疗后复发依然是亟待解决的瓶颈问题。肿瘤免疫治疗作为一种新型肿瘤治疗模式，主要通过激活机体的免疫系统产生抗肿瘤免疫，从而达到清除肿瘤细胞的目的,不但能引发持久的抗肿瘤免疫，而且对预防术后复发具有重要作用。树突状细胞(Dendriticcells，DC)作为机体产生特异性免疫反应的首要环节，是肿瘤免疫治疗的重要靶点。DC疫苗采用自体或异体肿瘤细胞成份致敏患者外周血来源的单核细胞诱导分化的DC，从而直接诱导特异性的免疫反应，现已成为肿瘤免疫治疗的重要手段。尽管临床研究表明，通过患者自体单核细胞诱导的DC疫苗能被患者较好的耐受，并能产生抗肿瘤免疫应答，但仍无法有效治疗肿瘤，原因可能与特异性肿瘤抗原缺乏、抗原负载效率低以及治疗后续调节性T细胞被激活，产生免疫抑制有关。尽管目前已建立了多种DC肿瘤疫苗制备方法，如用肿瘤细胞裂解物以及肿瘤相关抗原肽段直接致敏DC，将肿瘤相关抗原基因通过电穿孔、质粒DNA等载体转染DC或采用纳米载体负载肿瘤抗原刺激DC等手段。然而，由于DC对游离的抗原直接摄取效率低，因此，构建高效安全的DC疫苗抗原呈递载体是亟待解决的关键问题，也是当前DC疫苗产业面临的重要任务。癌症病人体内的自身免疫力往往较弱，且缺乏特异性的抗原激活免疫细胞，肿瘤免疫治疗的关键在于寻到肿瘤特异性的抗原。外泌体作为潜在的治疗肿瘤的药物已经引起了研究人员的广泛关注，在启动T细胞免疫应答中，需要DC的完全激活，CD40分子在DC的激活过程中具有很重要的作用，经过CD40配体基因修饰的肺癌细胞的外泌体具有更强的免疫原性，含有CD40的外泌体除了含有肿瘤细胞的抗原还富含CD40，可以有效活化DC，引起肿瘤抗原特异性的T细胞活化。这些研究表明，外泌体可能含有肿瘤细胞特异性的抗原，在肿瘤免疫治疗中具有非常重要的作用。从理论上讲，外泌体是一类由体内多种活细胞分泌的纳米级的双层膜结构小囊泡，可携带包含亲代细胞信息的核酸、蛋白质和脂质等，能够在细胞之间转移蛋白质、脂质和RNA。不同的细胞分泌的外泌体不同，其外泌体具备的生物学功能也有差别。此外，外泌体可以通过三种不同的途径刺激免疫细胞，一是通过与免疫细胞上的MHC复合物直接激活，二是通过外泌体MHC循环将抗原呈递到细胞表面，三是通过外泌体的降解和抗原呈递细胞的呈递作用，将肽加载到内源性的MHC分子上。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种肿瘤细胞来源外泌体抗原在DC疫苗中的应用方法。本专利技术提供了一种肿瘤疫苗的制备方法，包括如下步骤：采用肿瘤细胞外泌体致敏DC细胞，得到所述肿瘤疫苗。采用肿瘤细胞外泌体致敏DC细胞时，所述肿瘤细胞外泌体总蛋白浓度为25-100μg/ml。采用肿瘤细胞外泌体致敏DC细胞时，所述肿瘤细胞外泌体总蛋白浓度具体可为25μg/ml。所述“采用肿瘤细胞外泌体致敏DC细胞”的方法具体包括如下步骤：向DC细胞培养体系中加入肿瘤细胞外泌体，共培养1±0.5天。所述培养基为无血清的悬浮细胞培养基，具体可为AIM-V(Gibco，USA)培养基。所述肿瘤细胞外泌体的制备方法包括如下步骤：采用细胞培养液培养肿瘤细胞，从肿瘤细胞培养液上清中提取所述肿瘤细胞外泌体；所述细胞培养液中使用无外泌体的血清。所述“从肿瘤细胞培养液上清中提取所述肿瘤细胞外泌体”通过超速离心实现。所述“从肿瘤细胞培养液上清中提取所述肿瘤细胞外泌体”的方法具体包括如下步骤：(1)收集肿瘤细胞培养液上清，首先通过500g低速离心除去细胞和细胞碎片，再经过12000g离心后取上清，再次4℃、150000g的离心力离心2h；(2)完成步骤(1)后，采用含有0.1％(体积百分含量)Tween-20的PBS重悬沉淀，再以150000g、4℃离心2h；(3)完成步骤(2)后，采用无Ca2+、Mg2+的PBS重悬沉淀，得到肿瘤细胞外泌体。所述无外泌体的血清可通过将血清超速离心后取上清得到。所述超速离心具体可为4℃、150000g离心12h。所述肿瘤细胞培养上清具体可为培养48h的肿瘤细胞培养上清。所述肿瘤细胞为肺癌细胞；所述肿瘤疫苗为肺癌疫苗。本专利技术还保护任一所述的方法制备得到的肿瘤疫苗。本专利技术还保护一种产品，其活性成分为肿瘤细胞外泌体致敏的DC细胞；所述产品的用途为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)促进CD4+T和CD8+T细胞增殖；(a2)诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ和TNF-α；(a3)杀伤肿瘤细胞。本专利技术还保护肿瘤细胞外泌体或肿瘤细胞外泌体致敏的DC细胞在制备肿瘤疫苗中的应用。本专利技术还保护肿瘤细胞外泌体或肿瘤细胞外泌体致敏的DC细胞在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)促进CD4+T和CD8+T细胞增殖；(a2)诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ和TNF-α；(a3)杀伤肿瘤细胞。本专利技术还保护一种试剂盒，包括肿瘤细胞外泌体和DC细胞；所述试剂盒的用途为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)促进CD4+T和CD8+T细胞增殖；(a2)诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ和TNF-α；(a3)杀伤肿瘤细胞。以上任一所述DC细胞的制备方法具体可为：(I)采集离体的健康人外周血离心收集下层液体(浓缩的血细胞)；(Ⅱ)吸取步骤(I)得到的血细胞与淋巴细胞分离液混匀离心，吸取白膜层(单个核细胞)，离心收集细胞沉淀；(Ⅲ)采用无血清的悬浮细胞培养液培养重悬步骤(Ⅱ)得到的细胞沉淀并培养2h；(Ⅳ)完成步骤(Ⅲ)后，去除悬浮细胞和培养基，添加采用含有GM-CSF和IL-4细胞因子的培养基诱导培养得到DC细胞。所述无血清的悬浮细胞培养液具体可为AIM-V(Gibco，USA)培养基。所述含有GM-CSF和IL-4细胞因子的培养基，具体可为含有GM-CSF和IL-4细胞因子的AIM-V(Gibco，USA)培养基。以上任一所述肿瘤细胞具体可为肺癌细胞，更具体可为A549细胞。以上任一所述肿瘤细胞具体可为肺癌疫苗。本专利技术利用肿瘤细胞A549培养上清中外泌体作为DC抗原，用于抗肺肿瘤DC疫苗的构建，为研制高效的DC疫苗提供新思路。一方面利用外泌体脂膜结构提高入胞效率，另一方面培养上清中外泌体可携带A459细胞相关蛋白，因此肿瘤细胞上清外泌体显著提高体外PBM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肿瘤疫苗的制备方法，包括如下步骤：采用肿瘤细胞外泌体致敏DC细胞，得到所述肿瘤疫苗。/n

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤疫苗的制备方法，包括如下步骤：采用肿瘤细胞外泌体致敏DC细胞，得到所述肿瘤疫苗。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：采用肿瘤细胞外泌体致敏DC细胞时，所述肿瘤细胞外泌体总蛋白浓度为25-100μg/ml。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：采用肿瘤细胞外泌体致敏DC细胞时，所述肿瘤细胞外泌体总蛋白浓度为25μg/ml。


4.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：所述肿瘤细胞外泌体的制备方法包括如下步骤：采用细胞培养液培养肿瘤细胞，从肿瘤细胞培养液上清中提取所述肿瘤细胞外泌体；所述细胞培养液中使用无外泌体的血清。


5.如权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于：所述肿瘤细胞为肺癌细胞；所述肿瘤疫苗为肺癌疫苗。


6.如权利要求1-5任一所述的方法制备得到的肿瘤疫苗。


7.一种产品，其活性成分为...

【专利技术属性】
技术研发人员：王策，李富荣，黄雪，陈尚，
申请(专利权)人：深圳市人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44