一种葡萄糖氧化酶突变体及其载体与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种葡萄糖氧化酶突变体，所述葡萄糖氧化酶包括黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列，并且包括在第34、51、60、90、106、243和561位的氨基酸处的突变，其中，黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列如SED ID NO:1所示。所述葡萄糖氧化酶突变体采用毕赤酵母作为蛋白表达平台，能显著提升酶活，并且在酸性条件下，也能保持较高的相对酶活。

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄糖氧化酶突变体及其载体与应用
本专利技术涉及基因工程
，更具体地，涉及一种葡萄糖氧化酶突变体及其载体与应用。
技术介绍
葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GOD)在有氧条件下能专一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。GOD是同型二聚体分子，含有2个黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合位点。每个单体含有2个完全不同的区域：一个与部分FAD非共价但紧密结合，主要为声折叠；另一个与底物β-D-葡萄糖结合，由4个α-螺旋支撑1个反平行的β-折叠。葡萄糖氧化酶在自然界分布广泛，具有反应效率高的特点，催化特异性强的特点，在食品行业，饲料添加等方面得到广泛应用。葡萄糖氧化酶是一种以β-D-葡萄糖为底物的脱氢类酶制剂，因其在酶反应过程中消耗大量氧，形成葡萄糖酸具有酸化剂性质等特征被广泛应用于食品、养殖、医药等行业。饲料中添加葡萄糖氧化酶能有效改善动物肠道健康、提高饲料利用率、促进动物生长和增强机体的抗病能力，是一种绿色、安全、无毒副作用的饲料添加剂。随着近年来GOD不断的发展应用研究，其在食品、养殖和医药工业中应用已取得较大进展。葡萄糖氧化酶最早发现于20世纪初，之后在1928年，Muller在黑曲霉的无细胞提取液中首次发现葡萄糖氧化酶，并对其催化机理进行较为深入的研究；在1936年，KeilinD等人首次于灰绿青霉(Penicilliumglaucum)中发现葡萄糖氧化酶。顾磊等人使用毕赤酵母异源表达黑曲霉来源葡萄糖氧化酶，胞外酶活达到52U/mL，同时通过分子伴侣改造，使酶活活力到达1972.9U/mL，为近年来最高。微生物来源的GOD主要以黑曲霉和青霉为主，相对于青霉，黑曲霉产的GOD具有热稳定性好，底物特异性强等优点。野生型黑曲霉GOD比活力低，生产成本高，限制了其产业化应用。CN105002147A公开了表达量提高的突变葡萄糖氧化酶及其编码基因和应用，通过定点突变，使葡萄糖氧化酶的氨基酸序列突变位点为Y76C和Q279K，提高了表达量，且稳定性好。CN101348794A公开了一种高活力葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用，通过在黑曲霉GOD结构基因的1752位和2272位通过重叠PCR引入两处突变，连接于表达载体，提高了突变酶的酶活。CN103525778公开一种催化活性提高的葡萄糖氧化酶突变体，比野生型葡萄糖氧化酶提高了2.5倍。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于针对来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶进行分子改造，通过定点突变技术方法，为了提高黑曲霉AspergillusnigerGIM3.452(CICC2377)的葡萄糖氧化酶的比活，降低生产成本，提供一种葡萄糖氧化酶突变体。本专利技术要解决的另一技术问题在于提供编码上所述葡萄糖氧化酶突变体的核苷酸序列。本专利技术要解决的还一技术问题在于提供一种插入有上述核苷酸序列的载体。本专利技术要解决的还一技术问题在于提供含有上述载体的表达菌株。本专利技术要解决的还一技术问题在于提供上述葡萄糖氧化酶突变体在饲料添加剂、食品添加剂方面的应用。本专利技术要解决的还一技术问题在于提供上述的葡萄糖氧化酶突变体、核苷酸、载体或表达菌株在葡萄糖酸钠或葡萄糖酸钙的生产中的应用。本专利技术所采取的技术方案是：提供一种葡萄糖氧化酶突变体，包括黑曲霉AspergillusnigerGIM3.452(CICC2377)的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列，并且包括第34、51、60、90、106、243和561位氨基酸处的突变，所述黑曲霉AspergillusnigerGIM3.452(CICC2377)的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列如SEDIDNO:1所示。所述黑曲霉AspergillusnigerGIM3.452(CICC2377)的葡萄糖氧化酶的核苷酸序列如SEDIDNO:2所示。所述黑曲霉AspergillusnigerGIM3.452(CICC2377)的葡萄糖氧化酶根据毕赤酵母密码子偏好优化的核苷酸序列如SEDIDNO:3所示。具体地，所述第34位的苏氨酸突变为丝氨酸或缬氨酸；所述第51位的丝氨酸突变为甘氨酸、赖氨酸或脯氨酸；所述第60位的脯氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸或组氨酸；所述第90位的谷氨酰胺突变为甘氨酸、丙氨酸或精氨酸；所述第106位的缬氨酸突变为酪氨酸、半胱氨酸或异亮氨酸；所述第243位的谷氨酰胺突变为谷氨酸、组氨酸或缬氨酸；所述第561位的甲硫氨酸突变为丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸或丙氨酸。进一步地，所述葡萄糖氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO:4～9任一所示。提供编码上所述葡萄糖氧化酶突变体的核苷酸序列。更具体地，所述核苷酸序列如SEQIDNO:10～15任一所示。提供一种包括上述核苷酸序列的载体。提供一种含有上述载体的表达菌株。提供上述的葡萄糖氧化酶突变体在制备饲料添加剂、食品添加剂方面的应用。提供上述的葡萄糖氧化酶突变体、核酸、载体或表达菌株在葡萄糖酸钠或葡萄糖酸钙的生产中的应用。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术针对现有技术中构建得到的葡萄糖氧化酶生产菌的发酵能力较低，导致该酶的生产成本居高不下，制约了葡萄糖氧化酶的广泛应用的技术不足，通过对葡萄糖氧化酶进行蛋白质工程改造，提供一系列酶活显著提高的突变体蛋白。所提供的葡萄糖氧化酶突变体可在毕赤酵母中高效表达，并且具有更高的相对酶活，即使在酸性条件下，也能保持较高的相对酶活。附图说明图1葡萄糖氧化酶突变体在不同pH条件下的相对酶活。具体实施方式实验材料和试剂：1、菌株与载体黑曲霉AspergillusnigerGIM3.452(CICC2377)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，大肠杆菌菌株Top10、毕赤酵母X33、载体pPICZαA、载体pGAPzαA、抗生素Zeocin购自Invitrogen公司。2、酶与试剂盒PCR酶、质粒提取试剂盒、胶纯化试剂盒购于上海生工公司，限制性内切酶购于NEB公司。3、培养基大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCL，pH7.0)。LB-Amp为LB培养基加100μg/ml氨苄青霉素。LB-Zeocin为LB培养基加25μg/mlZeocin。酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDZ(YPD+100μg/mlZeocin)。酵母诱导培养基BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(v/v))和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成分与BMGY相同)。重组酵母发酵基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、消泡剂0.03％。高压后每升加4.35mlPTM1。PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％。一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、流水氯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种葡萄糖氧化酶突变体，包括黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列，并且包括第34、51、60、90、106、243和561位氨基酸处的突变，所述黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列如SED ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖氧化酶突变体，包括黑曲霉AspergillusnigerGIM3.452(CICC2377)的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列，并且包括第34、51、60、90、106、243和561位氨基酸处的突变，所述黑曲霉AspergillusnigerGIM3.452(CICC2377)的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列如SEDIDNO:1所示。


2.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述第34位的苏氨酸突变为丝氨酸或缬氨酸；所述第51位的丝氨酸突变为甘氨酸、赖氨酸或脯氨酸；所述第60位的脯氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸或组氨酸；所述第90位的谷氨酰胺突变为甘氨酸、丙氨酸或精氨酸；所述第106位的缬氨酸突变为酪氨酸、半胱氨酸或异亮氨酸；第243位的谷氨酰胺突变为谷氨酸、组氨酸或缬氨酸；所述第561位的甲硫氨酸突变为丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸或丙氨酸。


3.根据权利要求1或2所述的葡萄...

【专利技术属性】
技术研发人员：李阳源，黄江，何小梅，陈丽芝，刘金山，黄佳乐，陈琼银，冯国华，周银华，梁雪霞，
申请(专利权)人：广东溢多利生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44