一种甘草的新用途制造技术

本发明专利技术公开甘草中黄酮类和五环三萜类两大主要类别中的活性成分甘草苷，甘草素，异甘草苷，异苷草素，查尔酮A和甘草次酸对外排转运体P‑gp的诱导作用。主要通过研究给药后细胞中P‑gp的mRNA表达，蛋白表达，和外排转运功能，确认了甘草中的活性成分对P‑gp具有诱导作用。为药物配伍合理应用和临床药理研究提供了基础，为进一步理解甘草解毒机制提供了依据，并对临床上安全、有效用药具有重要的意义。

A new use of licorice

【技术实现步骤摘要】
一种甘草的新用途
本专利技术属于医药
，涉及一种甘草的新用途，特别涉及甘草在诱导P-gp从而减少外源物质进入细胞内方面的新用途。
技术介绍
甘草作为传统的经典中药，具有补脾益气、祛痰止咳、缓急止痛、清热解毒、调和诸药等药理作用。甘草可单用，亦多配伍使用。配伍使用时，多作为，具有解毒增效的作用。P-gp作为外排性转运体的经典类别，研究甘草对外排转运体的诱导作用，有利于更好地理解甘草的解毒机制，并且中药具有复杂多样性的特质，有些有毒的中药治疗窗狭窄，利用甘草诱导外排性转运体的特质，可以更合理化中药的配伍机制，拓宽治疗窗的范围。
技术实现思路
本专利技术目的在于公开甘草诱导P-gp的新用途。本专利技术利用甘草中黄酮和五环三萜两大类活性成分，甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素、甘草查尔酮A和甘草次酸，分别作用于LS-180和Caco-2细胞，在RT-PCR，WesternBlot，转运试验，功能验证试验中，都表现出甘草中的活性成分对P-gp具有诱导作用。附图说明图1：甘草中主要活性成分对LS-180细胞P-gpmRNA表达的影响；图2：甘草中主要活性成分对P-gp蛋白的影响；图3：甘草中主要活性成分对LS-180细胞P-gp外排罗丹明123的影响；图4：甘草中主要活性成分对Caco-2细胞P-gp外排罗丹明123的影响；图5：给药后Caco-2细胞随外排时间变化对P-gp外排罗丹明123的影响。具体实施方式本专利技术目的是通过如下实施例实现的：实施例1：RT-PCR1、材料与方法(1)仪器及试剂仪器：HERAcell150i二氧化碳培养箱：美国ThermoScientific公司产品。AB54-S型分析天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品。3K15型高速冷冻离心机：德国Sigma公司产品。SorvallLegendMicro17R高速冷冻离心机：美国ThermoScientific公司产品。EppendorfMastercyclerepRealplex2qPCR仪：德国Eppendorf公司产品。24孔聚碳酸酯膜转运板、细胞培养皿、离心管、移液管，CorningCostar公司试剂：甘草苷对照品(批号17030801)，甘草素对照品(批号17022104)，异甘草苷对照品(批号17031204)，异甘草素对照品(批号17012503)，查尔酮A对照品(批号17032501)，中国药品生物制品检定；β-甘草次酸对照品(批号1129A022)，Solarbio公司；利福平对照品(批号11246)，波生坦(批号HYA0013)，沙奎那韦对照品(批号05907)。DMSO，分析纯，天津市凯信化学工业有限公司。RPIM1640培养基，GibcoLaboratories公司；DMEM培养基来自Hyclone公司。Trypsin-EDTA、细胞冻存液，Gibco公司。胎牛血清(FBS)，兰州民海生物工程有限公司。槲皮素，批号：Q8010；青链霉素混合液(100×)，批号：20170907；PhosphateBufferedSaline(PBS)(1×)，批号：8112372；DEPC水，批号：20170727，由Solarbio出品。超纯水、HBSS，实验室自制。TRNzolReagent：由天根生化科技(北京)有限公司(Tiangenbiotech(Beijing)CO.LTD)出品，批号：Q5607。逆转录试剂盒TranscriptorFirstStrandcDNASynthesiskit，由Roche公司出品，批号：21457720。实时定量试剂盒FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Rox)，由Roche公司出品，批号：24759100。PCR引物：由深圳华大基因科技有限公司(华大)(BGI(Shenzhen，China))合成，引物经双蒸水溶解后，浓度均为10μM，引物序列见表1。表1外排型转运体RT-PCR引物序列(2)细胞培养LS-180细胞复苏后以2×105/mL密度接种于100mm*20mm的细胞培养皿中，加入10mL含10％FBS、1％双抗(青霉素10000U/ml和链霉素10000μg/ml)的RPMI-1640培养基。细胞在37℃、5％CO2的培养箱中培养，隔天换液，待细胞生长至80％～90％时用0.25％胰酶消化并传代，选取对数生长期的LS-180细胞用于实验。(3)实验分组空白组，阳性药组(利福平10μM、波生坦10μM、沙奎那韦10μM、槲皮素10μM)和给药组(甘草苷10μM、甘草素10μM、异甘草苷10μM、异甘草素10μM、甘草查尔酮A1μM和甘草次酸10μM)。(4)实验方法LS-180按细胞密度2*105接种于于Transwell聚碳酸酯膜24孔板中，隔天换培养基，连续更换空白和含药培养基3天，7天，10天后，吸去培养基，用Trizol法提取总RNA，参照逆转录试剂盒操作说明将细胞总RNA逆转录为cDNA。cDNA根据Roche公司FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Rox)说明书进行实时荧光定量PCR。PCR反应条件为：95℃10min，95℃15s，60℃1min，40个循环，β-actin为内参基因，相同模板相同基因设3复孔、3次平行实验。(5)数据处理及统计用Microsoftexcel输入所有测量结果计算各组均数、标准差及与空白组的显著性t检验。2、试验结果甘草中主要活性成分对LS-180细胞P-gpmRNA表达的影响：甘草中活性成分不同程度地诱导P-gpmRNA的表达，见表2，图1.表2甘草中活性成分对P-gpmRNA的表达影响结果注：与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01。实施例2：WesternBlot3、材料与方法(1)仪器及试剂仪器：培养箱：美国ThermoScientific公司产品。AB54-S型分析天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品。3K15型高速冷冻离心机：德国Sigma公司产品。SorvallLegendMicro17R高速冷冻离心机：美国ThermoScientific公司产品。基础电泳仪电源(威泰克有限公司ELITE300PLUSE5W0541)蛋白印迹仪(威泰克有限公司YrdimesSW07D0567)台式恒温振荡器(中国上海精宏实验设备有限公司THZ-312)凝胶成像分析系统(美国Li-COROdyssey双色红外激光成像系统)24孔聚碳酸酯膜转运板、细胞培养皿、离心管、移液管，CorningCostar公司试剂：甘草苷对照品(批号17030801)，甘草素对照品(批号17022104本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甘草及其主要活性成分在制备解毒药物中的用途。/n

【技术特征摘要】
1.一种甘草及其主要活性成分在制备解毒药物中的用途。


2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的甘草主要活性成分选自甘草苷，甘草素...

【专利技术属性】
技术研发人员：李亚卓，赫宇菲，慈小燕，伊秀林，曾勇，刘昌孝，谢莹，周华，
申请(专利权)人：天津药物研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12