一种利用雷帕霉素处理三角褐指藻提高岩藻黄素含量的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用雷帕霉素处理三角褐指藻提高岩藻黄素含量的方法，包括如下步骤：三角褐指藻的培养、三角褐指藻光密度回归方程和生长曲线测定、岩藻黄素的提取、岩藻黄素含量测定，为提高岩藻黄素含量还利用不同浓度的雷帕霉素处理三角褐指藻，寻找最适合的雷帕霉素处理浓度，通过该浓度对三角褐指藻的诱导处理，其岩藻黄素的含量增加显著，该发明专利技术操作简单方便，费用低，生产周期短，适于批量处理和工厂化生产，由于岩藻黄素对抗癌，高血糖，心血管疾病，糖尿病都有显著地功效，提高岩藻黄素的含量将满足人们治病的需要，并且能够提高经济效益。

A method of using rapamycin to treat Phaeodactylum tricornutum to increase the content of fucophyll

The invention relates to a method for treating Phaeodactylum tricornutum by rapamycin, which comprises the following steps: Cultivation of Phaeodactylum tricornutum, determination of light density regression equation and growth curve of Phaeodactylum tricornutum, extraction of Phaeodactylum, and determination of Phaeodactylum content. In order to improve the content of Phaeodactylum, different concentrations of rapamycin are also used to treat Phaeodactylum tricornutum to look for The most suitable rapamycin treatment concentration, through the induced treatment of Phaeodactylum tricornutum, the content of fucosin is significantly increased, the invention is simple and convenient to operate, low cost, short production cycle, suitable for batch processing and industrial production, because the fucosin has significant effect on cancer, hyperglycemia, cardiovascular disease, diabetes, and improves the content of fucosin It will meet the needs of people's disease treatment and improve economic benefits.

【技术实现步骤摘要】
一种利用雷帕霉素处理三角褐指藻提高岩藻黄素含量的方法
本专利技术涉及生物医药
，尤其是涉及一种利用雷帕霉素处理三角褐指藻提高岩藻黄素含量的方法。
技术介绍
岩藻黄素（fucoxanthin）是一类广泛存在于褐藻和硅藻中的类胡萝卜素。这种色素不仅存在于巨藻中，在微藻中也有发现。食物中获得的岩藻黄素在胃肠道中经过消化酶的作用被水解成岩藻黄醇，通过淋巴系统和血液循环系统，最终岩藻黄醇在组织中积累。岩藻黄素的结构非常的特殊。在它的分子结构中含有不同寻常的共轭双键和5,6-单环氧基。正是由于其拥有这种结构才使得其具有抗癌、抗肥胖、抗炎症、抗糖尿病以及抑制血管增生的作用。，对于岩藻黄素抗癌症的机理研究比较深入。根据所报道的机理来看，主要是通过促进细胞周期停滞和诱导细胞凋亡两种方式。其中，岩藻黄素通过促进细胞周期停滞的方式来抗癌主要在前列腺癌和肝癌的研究中发现，但是它们的靶标分子是不同的，分别为GADD45A和CyclinD。而诱导细胞凋亡的方式抑制癌细胞主要是在白血病和结肠癌的研究中发现的,靶标分子分别为Caspase-3,7,9和Bcl-2。近几年的研究中发现肥胖是引起II型糖尿病，高血脂和高血压的重要原因。Hayto等（2005）通过研究表明，岩藻黄素能够激活激活线粒体解偶联蛋白（UCP1蛋白）的转录。该蛋白存在两个作用，一是它能够促进脂肪的分解，二是通过在肝脏中生成DHA来降低胆固醇的含量。WAT在能量储存器官和内分泌器官中具有重要的作用。WAT能够产生如单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）和脂联素。在白色脂肪组织中，脂肪细胞因子的调节异常会引起血脂异常和高血压症状。Hosokawa等通过研究岩藻黄素对肥胖小鼠有关脂肪细胞因子相关mRNA转录情况。他们发现经岩藻黄素的作用下MCP-1、TNF-α和IL-6相关mRNA的转录下降非常明显，并且其体重比对照组也明显下降。诱导子能够诱导转录植物中的特定基因，从而提高植物的次生代谢产物。诱导子可以分为内源性诱导子和外源性诱导子，雷帕霉素属于外源性诱导子中不饱和脂肪酸类。它是一种重要的诱导子，在细胞内作为第二信使而直接产于胞内信号的转导，或通过对其它信号通路的调节间接影响细胞生物的活动。王丽丽等研究了不同质量浓度的雷帕霉素处理雨生红球藻，其细胞生长和虾青素含量影响。LeB等发现雷帕霉素能够诱导马铃薯产生植保素。三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum）是一种硅藻。Kim等发现在三角褐指藻中的岩藻黄素的含量要比巨藻中的还要高。因此三角褐指藻被认为是产岩藻黄素的商业藻种。本文通过利用不同浓度的雷帕霉素处理三角褐指藻，来研究三角褐指藻的生长状况，分离和提取三角褐指藻中的岩藻黄素并且利用HPLC对不同浓度的雷帕霉素处理下的三角褐指藻中岩藻黄素含量的测定。进而得出最适雷帕霉素的浓度，提高岩藻黄素的含量。为提高岩藻黄素含量提供有力的实验依据和实验手段。
技术实现思路
对上述现有技术的现状，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种利用雷帕霉素处理三角褐指藻提高岩藻黄素含量的方法。该方法对提高三角褐指藻中的岩藻黄素含量效果显著，操作简单方便，费用低，生产周期短，适于批量处理和工厂化生产。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：利用不同浓度的雷帕霉素处理三角褐指藻后其生长的变化趋势。利用无水乙醇萃取经不同浓度雷帕霉素处理后三角褐指藻中的岩藻黄素并且利用HPLC（高效液相色谱）的方法来检测岩藻黄素的含量。所述的雷帕霉素的浓度分别为0mg/L，0.1mg/L，0.5mg/L，2.5mg/L，12.5mg/L，62.5mg/L，312.5mg/L。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：专利技术首次公开了从三角褐指藻中提取岩藻黄素，为提高岩藻黄素含量还利用不同浓度的雷帕霉素处理三角褐指藻，寻找最适合的雷帕霉素处理浓度，通过该浓度对三角褐指藻的诱导处理，其岩藻黄素的含量增加显著。该专利技术操作简单方便，费用低，生产周期短，适于批量处理和工厂化生产。由于岩藻黄素对抗癌，高血糖，心血管疾病，糖尿病都有显著地功效，提高岩藻黄素的含量将满足人们治病的需要，并且能够提高经济效益。附图说明图1为实施例1三角褐指藻光密度曲线；图2为实施例2利用不同浓度雷帕霉素处理三角褐指藻后生长曲线；图3为实施例3实验组和对照组提取物HPLC图谱；图4为实施例4利用不同浓度雷帕霉素处理三角褐指藻后细胞岩藻黄素含量变化。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本专利技术进行进一步详细说明。一、实验方法1.三角褐指藻的培养取过滤且高温灭菌的海水，加入1:1000灭菌MAV母液。MAD母液的配方为：KNO3:10g,KH2PO4:1g,FeSO4.7H2O:0.25g,MnSO4:0.025g,EDTANa2：1g,VB1:0.0006,dH2O:100ml。以1:10比例接入藻液,,并在62.5μmolphotons/(m2·s)，25℃，12h/12h(黑暗/光照)条件下培养。每天分三个时间段（8:00,12:00,20:00)均匀摇藻体。2.三角褐指藻光密度回归方程和生长曲线测定取1ml藻液，倍比稀释，利用紫外可见分光光度计（6800型双光束，英国bibby科技有限公司）测定每组稀释液的OD680值，并且用血球计数法对各组样品计数。将所得数据建立三角褐指藻光密度回归方程。每天同一时段分别取1ml经不同浓度雷帕霉素处理的三角褐指藻并测定OD680值，每组均设3个平行。根据光密度回归方程得出各样品的细胞密度，建立经不同浓度雷帕霉素处理三角褐指藻后的生长曲线三角褐指藻标准曲线的测定3.岩藻黄素的提取由测定的生长曲线可知，经不同浓度雷帕霉素处理的三角褐指藻，在第6d基本处于平台期末，达到最大生物量。因此，在第6d时分别取80ml的处理三角褐指藻，分别作3个平行对其进行岩藻黄素的提取。将各组藻体在4℃，52000g，离心10min，弃上清，收集藻体。冷冻干燥2d，称重。研磨藻体，使得藻体充分成粉末状为止。分别取1ml无水乙醇（AR，国药集团化学试剂有限公司）上下重悬藻粉，4℃静置1h，使其充分溶解。4℃，52000g，离心10min，分别取1ml上清过滤膜（0.22µm，上海兴亚净化材料），4℃保存备用。4.岩藻黄素含量测定精确称取0.1mg的岩藻黄素标准品（宁波大学海洋生物工程重点实验室，取自铜藻），取1ml无水乙醇，通过倍比稀释的方法对其稀释。利用高效液相色谱（2695SeparationsModule，Waters）,以90%甲醇30min，100%甲醇10min，90%甲醇持续15min的程序在445nm处监测岩藻黄素。本实验所使用的色谱柱型号为250×4.6mml，D.S-5µm，12nm，AA12S05-2546WT，No.0425057734，Waters。通过积峰面积与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用雷帕霉素处理三角褐指藻提高岩藻黄素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：三角褐指藻的培养、三角褐指藻光密度回归方程和生长曲线测定、岩藻黄素的提取、岩藻黄素含量测定。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用雷帕霉素处理三角褐指藻提高岩藻黄素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：三角褐指藻的培养、三角褐指藻光密度回归方程和生长曲线测定、岩藻黄素的提取、岩藻黄素含量测定。


2.根据权利要求1所述的一种利用雷帕霉素处理三角褐指藻提高岩藻黄素含量的方法，其特征在于，三角褐指藻的培养步骤为：取过滤且高温灭菌的海水，加入1:1000灭菌MAV母液；MAD母液的配方为：KNO3:10g,KH2PO4:1g,FeSO4.7H2O:0.25g,MnSO4:0.025g,EDTANa2：1g,VB1:0.0006,dH2O:100ml；以1:10比例接入藻液,并在62.5μmolphotons/(m2·s)，25℃，12h/12h(黑暗/光照)条件下培养，每天分三个时间段（8:00,12:00,20:00)均匀摇藻体。


3.根据权利要求1所述的一种利用雷帕霉素处理三角褐指藻提高岩藻黄素含量的方法，其特征在于，三角褐指藻光密度回归方程和生长曲线测定步骤为：取1ml藻液，倍比稀释，利用紫外可见分光光度计测定每组稀释液的OD680值，并且用血球计数法对各组样品计数；将所得数据建立三角褐指藻光密度回归方程；每天同一时段分别取1ml经不同浓度雷帕霉素处理的三角褐指藻并测定OD680值，每组均设3个平行；根据光密度回归方程得出各样品的细胞密度，建立经不同浓度雷帕霉素处理三角褐指藻后的生长曲线三角褐指藻标准曲线的测定。


4.根据权利要求1所述的一种利用雷...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘浩，
申请(专利权)人：宁波维宁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33