一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂制造技术

本发明专利技术属于基因工程与生物医学工程技术领域，具体公开了一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂，包括一种能同时分泌IFNβ与MR成像的骨髓间充质干细胞。所述骨髓间充质干细胞由

A kind of mesenchymal stem cell preparation for immunotherapy of gliomas

The invention belongs to the technical field of gene engineering and biomedical engineering, in particular to an mesenchymal stem cell preparation for immunotherapy of glioma and traceable by magnetic resonance, including a bone marrow mesenchymal stem cell capable of secreting IFN \u03b2 and MR imaging at the same time. The bone marrow mesenchymal stem cells are composed of

【技术实现步骤摘要】
一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂
本专利技术涉及基因工程与生物医学工程
，具体地，涉及一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂。
技术介绍
胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，是严重危害人类健康的重大难治性疾病。我国胶质瘤的发病率、致残率及致死率均较高，给个人、家庭及社会带来沉重负担。尽管近年来胶质瘤的精准手术治疗及放、化疗技术取得了一定进展，但恶性胶质瘤的预后仍非常不理想，5年生存率不足10％，中位生存时间仅为12～15个月。免疫治疗通过调动机体自身免疫系统来抑制或杀伤肿瘤细胞，是目前肿瘤治疗领域的研究热点，也是最有前景的肿瘤治疗方法。干扰素β(Interferon-β,IFNβ)是连接机体固有免疫和适应性免疫的桥梁，能够启动自发性抗肿瘤T细胞应答，诱导抗肿瘤免疫，有望在胶质瘤治疗中发挥重要作用。然而，IFNβ半衰期短，在血液中很容易被分解，若通过全身给药需要高剂量才能在局部产生治疗效果，对人体毒性很大，很大程度上制约了IFNβ的临床应用。此外，常规的给药途径很难将IFNβ有效地递送入肿瘤内部，限制了其治疗效果。干细胞治疗作为一种新治疗模式，不仅在再生医学领域具有重要应用，在恶性肿瘤的治疗中也展现出极大应用前景。相对于其他干细胞，间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)来源丰富、取材方便，可在体外培养后进行自体移植，也可通过商业途径购买，不存在伦理学问题；同时具备低免疫原性、易于进行基因修饰等多种优势。更为重要的是，MSCs具备向胶质瘤趋化的特性，能主动通过血脑屏障到达胶质瘤实体。因此，MSCs被认为是胶质瘤靶向治疗药物的理想载体。然而，以往干细胞治疗胶质瘤的研究多采用组织病理学手段评估治疗效果及移植后干细胞的命运，缺乏活体、动态的可视化评价，因此在干细胞能否发挥治疗效果及移植后干细胞命运上存在很多争议。采用分子影像学手段在活体水平对移植干细胞的迁移、归巢、存活、分布等生物学过程进行实时、无创、纵向、连续、定性、定量、系统的观察，有助于准确评估干细胞治疗的有效性与安全性，指导制定及筛选最佳治疗模式，阐明干细胞与肿瘤的相互作用及潜在机制，是干细胞治疗临床转化的关键。在诸多分子影像学手段中，磁共振成像(magneticresonanceimaging,MRI)具备无创、无电离辐射、能够多方位及多参数成像、软组织分辨率高等优点，能够在清晰地显示组织器官解剖结构及功能信息的同时，对干细胞在深部组织的分布进行精准的评估，是目前干细胞活体示踪中最安全有效、运用最广泛的手段。以往研究多采用超顺磁性氧化铁(superparamagneticironoxide,SPIO)纳米颗粒直接标记MSCs进行MRI活体示踪。然而，SPIO等直接标记示踪法示踪时间短，或被巨噬细胞吞噬后产生“假阳性”信号，无法真实反映移植细胞的存活情况。间接标记法通过MR报告基因的持续表达产生特异性信号而达到示踪目的，可以弥补外源性对比剂直接标记法的不足。铁蛋白重链(FerritinH,FTH)基因通过增加细胞内铁的储存，形成更多的氧化铁颗粒，缩短细胞局部横向弛豫时间，从而在MRI的T2WI和T2*WI序列上产生对比信号，是目前应用最为成熟的MR报告基因。目前尚未见有将IFNβ基因和铁蛋白重链(FerritinH)基因同时整入间充质干细胞基因组内，用于治疗颅内胶质瘤的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂，包括一种能同时分泌IFNβ与MR成像的骨髓间充质干细胞。所述骨髓间充质干细胞在体内移植后，在通过FerritinH报告基因被MRI活体示踪实现干细胞实时定位的同时，还能通过分泌IFNβ调节肿瘤免疫微环境，对胶质瘤生长发挥抑制作用，在临床上具有广阔的应用前景。本专利技术的另一目的在于提供一种用于治疗胶质瘤的试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂，包括一种能同时分泌IFNβ与MR成像的骨髓间充质干细胞。优选地，所述的骨髓间充质干细胞由FerritinH和IFNβ基因联合修饰，能同时表达分泌蛋白IFNβ和胞质蛋白FerritinH。优选地，所述的胶质瘤为颅内原位胶质瘤。更优选地，所述的胶质瘤为C6胶质瘤细胞。本专利技术通过对MSCs进行IFNβ与FerritinH联合基因修饰，促进其分泌IFNβ，利用MSCs主动趋向胶质瘤的特性，实现胶质瘤内IFNβ精准输送，调节肿瘤免疫微环境；同时通过FerritinH报告基因成像监测MSCs移植后的生物学行为及肿瘤治疗效果。所述骨髓间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：S1.构建FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒载体；S2.采用S1所得FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒载体转染骨髓间充质干细胞。本专利技术人综合考虑了基因表达载体，尤其是病毒载体可容纳的外源性基因片段长度有限，对载体的设计策略进行优化，根据目的基因的种类、数目、靶细胞的类型，以及目的蛋白功能选择了自剪切多肽2A(self-cleaving2Apeptide)中的T2A元件连接两个目的基因。T2A元件可以将多个目的基因连接成一条开放阅读框，再通过高效的“剪切”作用，将翻译后初级产物瞬时断裂为多个独立的蛋白，从而使各个目的基因均能有长期、稳定、高效地表达。T2A元件具有结构短小，表达效率高(85％～100％)，上、下游基因等比例表达，以及多个2A结构间不存在干扰等多种优势。优选地，S1所述构建FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒载体的具体步骤为：获取大鼠FerritinH与IFNβ序列，设计特异性引物对，PCR扩增FerritinH-T2A-IFNβ；将PCR产物连接入GV367转移载体，构建重组质粒，采用阳性克隆基因测序及目的基因表达检测验证；用重组质粒、包装质粒及包膜质粒共转染293T细胞，制备慢病毒颗粒，即得FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒载体。经阳性克隆基因测序及目的基因表达检测验证，结果表明慢病毒载体构建成功；制备慢病毒颗粒后测定病毒滴度，结果表明病毒滴度为2×108TU/mL。优选地，S2所述转染的具体步骤为：采用感染复数为10，转染时间为10h转染骨髓间充质干细胞，经2μg/mL嘌呤霉素筛选7d后再采用含1μg/mL嘌呤霉素的完全培养基连续培养，即得稳定表达抗性基因的FerritinH-T2A-IFNβ-MSCs。结合实施例相关实验，结果表明，FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒载体能成功地对MSCs进行基因修饰获得基因工程化干细胞FerritinH-IFNβ-MSCs，基因工程化MSCs既能分泌免疫调节因子IFNβ，又能通过FerritinH报告基因被临床MR设备活体示踪，同时保持了MSCs的干性、活性及分化能力。活体移植的Ferr本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂，其特征在于，包括一种能同时分泌IFNβ与MR成像的骨髓间充质干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂，其特征在于，包括一种能同时分泌IFNβ与MR成像的骨髓间充质干细胞。


2.根据权利要求1所述的间充质干细胞制剂，其特征在于，所述的骨髓间充质干细胞由FerritinH和IFNβ基因联合修饰，能同时表达分泌蛋白IFNβ和胞质蛋白FerritinH。


3.根据权利要求1所述的间充质干细胞制剂，其特征在于，所述的胶质瘤为颅内原位胶质瘤。


4.根据权利要求3所述的间充质干细胞制剂，其特征在于，所述的胶质瘤为C6胶质...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈君，毛家骥，曹明慧，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44