本发明专利技术公开了一种沙雷氏菌及其在蛋白酶生产中的应用，属于微生物技术领域以及发酵技术领域。本发明专利技术筛选出了一种沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG‑D15，此沙雷氏菌JWG‑D15可高产氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白酶，将此沙雷氏菌JWG‑D15在大米蛋白的诱导下摇瓶发酵2d，可使发酵上清液中的蛋白酶酶活高达400～460U/mL；将此沙雷氏菌JWG‑D15发酵获得的蛋白酶以终酶活500U/mL的添加量加入大米蛋白浓度为10g/L的大米蛋白分散液中进行反应，仅需反应2h，即可使反应上清液中的大米寡肽含量高达62.5％且游离氨基酸含量低至9.4％。
A Serratia and its application in protease production
The invention discloses Serratia and its application in protease production, belonging to the technical field of microorganism and fermentation. The invention has screened out a protease of Serratia sp. jwg-d15, which can produce high amino acid sequence as shown in SEQ ID No.1. The protease of Serratia sp. jwg-d15 can be fermented in shaking flask for 2 days under the induction of rice protein, and the egg white enzyme activity in the supernatant of fermentation can reach 400-460u / ml; the protease obtained by fermentation of Serratia sp. jwg-d15 can end with enzyme activity of 500 The amount of U / ml was added into the rice protein dispersion with the concentration of 10G / L of rice protein to react. Only 2H was needed for the reaction, the content of rice oligopeptide in the reaction supernatant was as high as 62.5% and the content of free amino acid was as low as 9.4%.
【技术实现步骤摘要】
一种沙雷氏菌及其在蛋白酶生产中的应用
本专利技术涉及一种沙雷氏菌及其在蛋白酶生产中的应用，属于微生物
以及发酵
技术介绍
大米蛋白是公认的优质蛋白，相对于大豆蛋白、乳清蛋白等蛋白而言，其营养抑制因子含量少，无过敏反应，包含人体所需氨基酸，氨基酸配比合理，且生物价远超大豆蛋白，可与虾及牛肉等的生物价相媲美，符合世界卫生组织(WHO)推荐的理想模式。大米蛋白水解成短肽后，还可以制成营养价值更高的短肽营养液，作为高价值添加剂运用于保健品、饮料、化妆品等行业。在大米肽中，由2～10个氨基酸组成且分子量在180～1000Da之间的蛋白肽统称为“寡肽”，寡肽可被人体迅速吸收且吸收速率高出游离氨基酸70～80％，不仅不会引起营养过剩等副作用，而且还可以调节人体营养平衡，故而寡肽含量是大米肽品质的关键指标，提升寡肽含量、降低游离氨基酸含量则是大米肽产品追求的目标。目前，大米寡肽的制备方法主要有酶解法、微生物发酵法、酸碱解法、化学合成法等，其中，酶解法是工业上可行，安全性高，而且绿色环保的一种方法。但是，酶解法具有许多缺陷，例如，公开号为CN1102229643A的专利中所记载的制备方法可使所得大米肽产品中的寡肽含量高达50％左右，但其在制备过程中需采用多种酶制剂协同酶解，并且，其需要使用中空纤维膜，这大大延长了大米肽产品的生产周期，增加了大米肽产品的工业生产成本；公开号为CN106967773A的专利中所记载的制备方法也可使所得大米肽产品中的寡肽含量高达50％左右，但其在制备过程中所采用的酶为亮氨酸和脯氨酸氨肽酶，亮氨酸和脯氨酸氨肽酶均为内切蛋白酶，切割多肽末端，使得用此法制备得到的大米肽产品中的游离氨基酸含量高达35％左右，这大大影响了大米肽产品的质量；公开号为CN103440949A的专利则先采用粉碎、调浆、洗涤、调浆、反应、浓缩、脱水等步骤对大米米渣进行预处理，然后再采用多种蛋白酶协同处理经预处理的大米米渣，但是，此方法主要以预处理方式提高大米肽产品中的寡肽含量，其酶解过程前后，大米肽产品中的寡肽含量变化不显著，并且，此方法制备步骤繁琐、能耗大、加酶量大，不利于工业化进程。因此，急需找到一种新的制备大米寡肽的方法以克服上述缺陷。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提供一种可高效生产大米寡肽的方法。[技术方案]为解决上述问题，本专利技术提供了一种沙雷氏菌(Serratiasp.)，所述沙雷氏菌(Serratiasp.)已于2019年06月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2019417，保藏地址为中国武汉，武汉大学。所述沙雷氏菌(Serratiasp.)来源于于江苏省无锡市地区的大米加工厂厂区内土壤样本，该菌株经测序分析，其16SrDNA序列如SEQIDNO.3所示，将测序得到的序列在Genbank中进行核酸序列比对，发现其16SrDNA序列与GenbankAccessionNumberJMPQ01000005的沙雷氏菌(Serratiamarcescenssubsp.marcescens)16SrDNA序列相似度高达99.17％，将与其相似度高的菌株构建系统进化树(具体可见图1)，结果显示菌株属于沙雷氏菌属，将其命名为沙雷氏菌(Serratiasp.)JWG-D15。所述沙雷氏菌(Serratiasp.)JWG-D15在LB培养基上的菌落呈圆隆形凸起，浅红色，不透明，表面光滑，湿润有光泽，边缘整齐(具体可见图2)。本专利技术还提供了一种蛋白酶，所述蛋白酶来源于上述沙雷氏菌(Serratiasp.)且所述蛋白酶为：(a)由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有蛋白酶活性的由(a)衍生的蛋白质。本专利技术还提供了一种基因，所述基因编码上述蛋白酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因。本专利技术还提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带上述基因或上述重组质粒。本专利技术还提供了上述沙雷氏菌(Serratiasp.)在生产蛋白酶方面的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述蛋白酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了上述蛋白酶或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在生产蛋白肽方面的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述蛋白肽为植物蛋白肽或动物蛋白肽。在本专利技术的一种实施方式中，所述植物蛋白肽为大米肽、大豆肽、玉米肽或高粱肽。在本专利技术的一种实施方式中，所述大米肽为大米寡肽。在本专利技术的一种实施方式中，所述动物蛋白肽为胶原肽、骨髓肽或骨肽。本专利技术还提供了一种生产上述蛋白酶的方法，所述方法为先将上述沙雷氏菌(Serratiasp.)接种于发酵培养基中进行发酵，得到含有蛋白酶的发酵液，然后将发酵液进行提取，得到蛋白酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵的温度为30～37℃、转速为150～200rpm。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵的温度为30℃、转速为200rpm。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含大米蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含5g/L大米蛋白、2g/L牛肉膏、1g/LK2HPO4、1g/LNaH2PO4以及0.5g/LMgSO4。本专利技术还提供了一种生产大米寡肽的方法，所述方法为以大米蛋白为底物，在含有大米蛋白的溶液中加入上述蛋白酶进行酶解，得到大米寡肽。在本专利技术的一种实施方式中，所述蛋白酶在含有大米蛋白的溶液中的添加量为500～1000U/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述蛋白酶在含有大米蛋白的溶液中的添加量为500U/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述酶解的温度为35～40℃、转速为180～200rpm。在本专利技术的一种实施方式中，所述酶解的温度为40℃、转速为200rpm。[有益效果](1)本专利技术筛选出了一种沙雷氏菌(Serratiasp.)JWG-D15，此沙雷氏菌(Serratiasp.)JWG-D15可高产氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蛋白酶，将此沙雷氏菌(Serratiasp.)JWG-D15在大米蛋白的诱导下摇瓶发酵2d，可使发酵上清液中的蛋白酶酶活高达400～460U/mL。(2)本专利技术提供了一种来源于沙雷氏菌(Serratiasp.)JWG-D15的、氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蛋白酶，此蛋白酶可高效酶解大米蛋白，将此蛋白酶以终酶活500U/mL的添加量加入大米蛋白浓度为10g/L的大米蛋白分散液中进行反应，仅需反应2h，即可使反应上清液中的大米寡肽含量高达62.5％。(3)本专利技术提供了一种来源于沙雷氏菌(Serratiasp.)JWG-D15的、氨基酸序列如SEQIDNO.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种沙雷氏菌(Serratia sp.)，其特征在于，所述沙雷氏菌(Serratia sp.)已于2019年06月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019417，保藏地址为中国武汉，武汉大学。/n
【技术特征摘要】
1.一种沙雷氏菌(Serratiasp.)，其特征在于，所述沙雷氏菌(Serratiasp.)已于2019年06月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2019417，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
2.一种蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶来源于权利要求1所述沙雷氏菌(Serratiasp.)且所述蛋白酶为：
(a)由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有蛋白酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
3.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求2所述的蛋白酶。
4.如权利要求3所述的一种基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
5.一种重组质粒，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，颜正飞，唐诚业，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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