提高L-精氨酸菌株生产能力的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高L‑精氨酸产生菌生产能力的方法，包括下述步骤：敲除谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的argR基因，获得基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)；对基因敲除菌株的基因组中argB基因进行A26V和M31V突变，获得基因突变菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26V M31V))；对基因突变菌株的基因组中ATP依赖的DNA解旋酶基因NCgl0742碱基序列进行V386M突变，获得基因工程菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26V M31V),NCgl0742mut3)。本发明专利技术的方法能够将菌株的L‑精氨酸生产能力提高至少14倍。

Methods to improve the production capacity of L-arginine strains

The invention discloses a method for improving the production capacity of L \u2011 arginine producing bacteria, which comprises the following steps: knock out the argR gene in the genome of Corynebacterium glutamicum atcc13032, obtain the gene knock-out strain atcc13032 (\u0394 argR); carry out a26v and m31v mutations on the ARGB gene in the genome of the gene knock-out strain, obtain the gene mutation strain atcc13032 (\u0394 argR, argbmut (a26v m31v)); and The nucleotide sequence of ncgl0742, an ATP dependent DNA helicase gene, was mutated to v386m in the genome of the mutant strain, and atcc13032 (\u0394 argR, argbmut (a26v m31v), ncgl0742mut3) was obtained. The method of the invention can increase the production capacity of L-arginine of the strain by at least 14 times.

【技术实现步骤摘要】
提高L-精氨酸菌株生产能力的方法
本专利技术属于基因工程领域，具体地说，涉及一种提高L-精氨酸菌株生产能力的方法，尤其涉及一种通过基因工程提高L-精氨酸产生菌生产能力的方法。
技术介绍
L-精氨酸(L-argnine，简称L-Arg)是人体内所需半必需碱性氨基酸之一，作为一种含有胍基的碱性氨基酸，是生物体尿素循环的一种重要中间代谢物，具有多种独特的生理和药理作用，对于治疗生理功能、心血管疾病、激励免疫系统、维持婴儿的营养平衡、促进人体解毒等都具有良好的疗效，被专家称为是机体内运输和贮存氨基酸的重要载体，在肌内代谢中极为重要。它是合成胞浆蛋白和核蛋白的必需氨基酸；作为唯一的氨来源参与肌酸的合成；作为尿素循环的重要中间体，在肝脏中扮演着排除多余氨的角色，防止氨过量积累而引起中毒；它还具有调节人体免疫力的功能，可抑制肿瘤生长、促进受伤组织愈合等。并且，精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。因此，L-精氨酸在医药、食品及化工领域方面具有重要而广泛的应用。比如，在临床上，除作为复方氨基酸输液的主要组分之一外，L-精氨酸及其盐类还广泛用于治疗各类肝昏迷忌用谷氨酸钠者和病毒性肝类谷丙转氨酶异常者，对病毒性肝炎疗效显著。对肠道溃疡、血栓形成和神经衰弱等症都有治疗效果。另外，L-精氨酸是运动营养饮料配方的重要组成部分，也是一种重要的饲料添加剂，还广泛地应用于高端养殖业。据统计，目前全世界L-精氨酸需求量在15000吨以上，并且需求量以每年12％-15％的速度增长。L-精氨酸的生产方法有两种：一是蛋白质水解提取法，二是微生物发酵法。水解法存在操作费时，收率和产量低，成本高等问题，并且存在严重的污染而不适合大规模的生产。发酵法生产L-精氨酸工艺相对简单，且对环境友好，因此具有很大的发展潜力，成为国内外氨基酸工业的一个重要趋势。国际上著名的氨基酸公司比如日本味之素、协和发酵和德国迪高沙主要采用生物发酵和基因工程技术进行L-精氨酸生产。但是，国内的微生物发酵生产L-精氨酸的产酸水平普遍较低，成本较高，生产水平和产量远远不能满足国内需求，因此提高L-精氨酸发酵水平的研究具有重要的意义。L-精氨酸的发酵菌种研究得较多的主要有谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等，但目前用来生产L-精氨酸的微生物菌株主要是谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌。基因工程技术对于精氨酸高产菌选育具有重要的推动作用，利用基因工程构建L-精氨酸高产菌株是一种高效率、理性化的育种手段，但构建筛选出适合于工业规模生产的高产重组菌始终是一种迫切的需求。
技术实现思路
为了克服现有L-精氨酸生产菌株发酵水平低的缺陷，本专利技术利用基因工程技术来改造谷氨酸棒杆菌，通过增强与L-精氨酸产生相关的基因、弱化分支代谢途径，能够使菌株的L-精氨酸生产能力大幅度提高。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种提高L-精氨酸产生菌生产能力的方法，包括以下步骤：A.敲除谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的argR基因，获得基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)；B.对步骤A中所述基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)的基因组中argB基因进行A26V和M31V突变，获得基因突变菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26VM31V))；C.对步骤B中所述基因突变菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26VM31V))的基因组中ATP依赖的DNA解旋酶基因(NCgl0742)碱基序列进行V386M突变，获得L-精氨酸生产能力比所述基因突变菌株提高的基因工程菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26VM31V),NCgl0742mut3)。在一种实施方式中，上述步骤A中所述的基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)通过下述方法制备：A1.以ATCC13032基因组为模板，使用序列为SEQIDNO:1的引物argR-aL-F和序列为SEQIDNO:2的引物argR-aL-R进行PCR扩增，得到约1kb的argR-aL片段；A2.以ATCC13032基因组为模板，使用序列为SEQIDNO:3的引物argR-aR-F和序列为SEQIDNO:4的引物argR-aR-R进行PCR扩增，得到约1kb的argR-aR片段；A3.使用HindIII和EcoRI酶切GenBank登录号为FJ437239.1的质粒pK18mobsacB，胶回收得到5.7kb载体片段；A4.Gibson连接上述argR-aL片段、argR-aR片段和载体片段，转化DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素LB平板，过夜培养；A5.使用引物argR-aL-F和argR-aR-R进行PCR扩增验证转化子，得到质粒pK18mobsacB-argR；A6.制备谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞；A7.将质粒pK18mobsacB-argR转化入ATCC13032感受态细胞；A8.进行SacB蔗糖反筛，使用引物argR-aL-F和argR-aR-R进行PCR扩增，验证在BHIS平板生长而在含卡那霉素的BHIS平板不能生长的转化子，得到菌株ATCC13032(ΔargR)。在一种实施方式中，上述步骤B中所述的基因突变菌株通过下述方法制备：B1.以ATCC13032基因组为模板，使用序列为SEQIDNO:5的引物argB-aL-F和序列为SEQIDNO:6的引物argB-aL-R进行PCR扩增，得到约1kb的argB-aL片段；B2.以ATCC13032基因组为模板，使用序列为SEQIDNO:7的引物argB-aR-F和序列为SEQIDNO:8的引物argB-aR-R进行PCR扩增，得到约1kb的argB-aR片段；B3.使用HindIII和EcoRI酶切GenBank登录号为FJ437239.1的质粒pK18mobsacB，胶回收得到5.7kb载体片段；B4.Gibson连接上述argB-aL片段、argB-aR片段和载体片段，转化DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素LB平板，过夜培养；B5.使用引物argB-aL-F和argB-aR-R进行PCR扩增验证转化子，得到质粒pK18mobsacB-argBmut；B6.制备谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(ΔargR)感受态细胞；B7.将质粒pK18mobsacB-argBmut转化入ATCC13032(ΔargR)感受态细胞；B8.进行SacB蔗糖反筛，使用引物argB-aL-F和argB-aR-R进行PCR扩增，验证在BHIS平板生长而在含卡那霉素的BHIS平本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高L-精氨酸产生菌生产能力的方法，包括以下步骤：/nA.敲除谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的argR基因，获得基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)；/nB.对步骤A中所述基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)的基因组中argB基因进行A26V和M31V突变，获得基因突变菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26V M31V))；/nC.对步骤B中所述基因突变菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26V M31V))的基因组中ATP依赖的DNA解旋酶基因NCgl0742碱基序列进行V386M突变，获得L-精氨酸生产能力比所述基因突变菌株提高的基因工程菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26V M31V),NCgl0742mut3)。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高L-精氨酸产生菌生产能力的方法，包括以下步骤：
A.敲除谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的argR基因，获得基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)；
B.对步骤A中所述基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)的基因组中argB基因进行A26V和M31V突变，获得基因突变菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26VM31V))；
C.对步骤B中所述基因突变菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26VM31V))的基因组中ATP依赖的DNA解旋酶基因NCgl0742碱基序列进行V386M突变，获得L-精氨酸生产能力比所述基因突变菌株提高的基因工程菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26VM31V),NCgl0742mut3)。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)通过下述方法制备：
A1.以ATCC13032基因组为模板，使用序列为SEQIDNO:1的引物argR-aL-F和序列为SEQIDNO:2的引物argR-aL-R进行PCR扩增，得到约1kb的argR-aL片段；
A2.以ATCC13032基因组为模板，使用序列为SEQIDNO:3的引物argR-aR-F和序列为SEQIDNO:4的引物argR-aR-R进行PCR扩增，得到约1kb的argR-aR片段；
A3.使用HindIII和EcoRI酶切GenBank登录号为FJ437239.1的质粒pK18mobsacB，胶回收得到5.7kb载体片段；
A4.Gibson连接上述argR-aL片段、argR-aR片段和载体片段，转化DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素LB平板，过夜培养；
A5.使用引物argR-aL-F和argR-aR-R进行PCR扩增验证转化子，得到质粒pK18mobsacB-argR；
A6.制备谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞；
A7.将质粒pK18mobsacB-argR转化入ATCC13032感受态细胞；
A8.进行SacB蔗糖反筛，使用引物argR-aL-F和argR-aR-R进行PCR扩增，验证在BHIS平板生长而在含卡那霉素的BHIS平板不能生长的转化子，得到菌株ATCC13032(ΔargR)。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述基因突变菌株通过下述方法制备：
B1.以ATCC13032基因组为模板，使用序列为SEQIDNO:5的引物argB-aL-F和序列为SEQIDNO:6的引物argB-aL-R进行PCR扩增，得到约1kb的argB-aL片段；
B2.以ATCC13032基因组为模板，使用序列为SEQIDNO:7的引物argB-aR-F和序列为SEQIDNO:8的引物argB-aR-R进行PCR扩增，得到约1kb的argB-aR片段；
B3.使用HindIII和EcoRI酶切GenBank登录号为FJ437239.1的质粒pK18mobsacB，胶回收得到5.7kb载体片段；
B4.Gibson连接上述argB-aL片段、argB-aR片段和载体片段，转化DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素LB平板，过夜培养；
B5.使用引物argB-aL-F和argB-aR-R进行PCR扩增验证转化子，得到质粒pK18mobsacB-argBmut；
B6.制备谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(ΔargR)感受态细胞；
B7.将质粒pK18mobsacB-argBmut转化入ATC...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晟，蒋宇，杨俊杰，董枫，刘映淼，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31