一种灯芯式纸微流控三维细胞培养纸芯片、制备方法及其在药物筛选中的应用技术

本发明专利技术公开了一种灯芯式纸微流控三维细胞培养纸芯片、制备方法及其在药物筛选中的应用。所述的灯芯式纸微流控三维细胞培养装置由两层印有不同通道的下层纸芯片和上层纸芯片按设计图案对齐后叠加粘贴而构成：其中上层纸芯片用于细胞的接种及培养，下层纸芯片通过折叠形成灯芯式纸柱，并利用其毛细作用实现培养基自主持续供液。本灯芯式纸微流控装置应用于三维细胞培养及抗癌药物的快速筛选。本发明专利技术灯芯式纸柱自主持续供应培养基，在芯片上实现三维细胞连续培养，在此基础上基于细胞与药物间的相互作用结合显色分析可实现药物筛选。该纸芯片以及基于此的筛选方法成本低廉，操作简单，分析速度快，便携化，可广泛应用于细胞分析和药物筛选领域。

A wick paper microfluidic three-dimensional cell culture paper chip, preparation method and its application in drug screening

The invention discloses a wick paper microfluidic three-dimensional cell culture paper chip, a preparation method and an application in drug screening. The wick paper microfluidic three-dimensional cell culture device is composed of two layers of lower layer paper chips printed with different channels and upper layer paper chips aligned according to the design pattern, and then stacked and pasted: the upper layer paper chips are used for cell inoculation and culture, the lower layer paper chips are folded to form wick paper columns, and the capillary effect is used to realize the independent and continuous liquid supply of the culture medium. The wick paper microfluidic device is applied to three-dimensional cell culture and rapid screening of anticancer drugs. Based on the interaction between cells and drugs and color analysis, drug screening can be realized. The paper chip and the screening method based on it are cheap, simple, fast and portable, and can be widely used in cell analysis and drug screening.

【技术实现步骤摘要】
一种灯芯式纸微流控三维细胞培养纸芯片、制备方法及其在药物筛选中的应用
本专利技术涉及一种灯芯式纸微流控三维细胞培养装置及药物筛选应用，属于细胞三维培养以及药物筛选的

技术介绍
目前细胞培养主要将癌细胞二维培养在细胞培养皿或多孔板中进行，该类型培养方式在多个方面不能满足仿真生理条件的需要，而三维细胞培养具有更接近机体环境的优势。而药物筛选作为新药研发过程中最为重要的阶段之一，选择合适的筛选模型可以有效缩短时间、降低成本和提高效率，对癌症的早期诊断和治疗具有十分重要的意义。近来微流控芯片技术得到了迅速的的发展，带来了细胞研究平台的革新。目前普遍使用的芯片材料，如玻璃和PDMS并不具有通透性，因而不能有效模拟体内膜性结构，自2007年哈佛大学Whitesides研究小组提出了纸微流控芯片的概念以来，得到了迅速的发展，目前有文献将纸作为细胞培养的基材，但仍需将细胞包裹在凝胶中，导致后续的进一步细胞分析操作仍较为复杂，同时结果分析依赖酶标仪等仪器，且同时存在培养基需要人为更新等问题。因此亟待开发一种新型的，低成本的，自动化程度高的三维细胞培养装置应用于抗癌药物的快速筛选。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灯芯式纸微流控三维细胞培养纸芯片、制备方法，并实现低成本三维细胞培养以及快速药物筛选的应用。本专利技术的具体内容是：一种灯芯式纸微流控三维细胞培养纸芯片，是由两张印有不同通道图案的上层纸芯片和下层纸芯片按设计图案对齐后叠加粘贴而成的双层结构。本专利技术还提出了一种纸芯片的制备方法，包括如下步骤：(1)上层纸芯片设置有亲水性圆孔细胞培养区，用于细胞的接种与培养，其余区域为蜡印疏水区(如图1蓝色芯片1所示)；(2)下层纸芯片设置有与上层培养区相同尺寸的圆孔浸润区，以浸润区为起点分别向外延伸出长型流通通道，并将长型通道的外延端折叠成灯芯式纸柱，用于培养基的自主供液，浸润区和流通通道为亲水区(如图1中的红色芯片2所示)。(3)若单独使用上层纸芯片，无法实现培养基供给；若单独使用下层纸芯片，细胞悬浮液会流经通道内，无法全部截留在细胞培养区内。(4)因此首先利用画图软件设计出纸芯片图案，通过喷蜡打印的方式在滤纸的相应疏水区均布蜡层疏水材料，并通过烘烤加热制成含亲疏水区域的上层纸芯片和下层纸芯片；(5)然后将上层纸芯片与下层纸芯对应叠加粘贴，上层的每个细胞培养区分别覆盖下层的浸润区，灯芯式纸柱插入含培养基的容器槽中，培养基经灯芯纸柱的毛细作用源源不断地供给至浸润区，从而湿润上层的细胞培养区，保证细胞在充足的培养基环境中生存繁殖。(6)根据细胞大小，其中用于接种细胞的上层纸芯片选用孔径较小的滤纸，小孔径滤纸可以更好地截留细胞在上层细胞培养区内；用于培养基供给的下层纸芯片选用孔径较大的滤纸，大孔径滤纸可增加培养基的供给量和流速。(7)上层纸芯片与下层纸芯片通过层叠粘合组装。(8)将上述制作好的双层纸芯片置于超净台中紫外照射24h灭菌后，室温储存以便后续使用。(9)为了提高药物筛选能量，本专利技术还提供了一种用于药物筛选的高通量纸芯片的接种孔数量设置为12个圆形(如图2所示)。本专利技术在上述灯芯式纸微流控三维细胞培养纸芯片的基础上，还开发建立了一种基于该装置的药物筛选应用，用于快速高效筛选直接与细胞相互作用的药物。(1)如上述
技术实现思路
所述，在高通量的灯芯式纸微流控装置上接种培养细胞；(2)根据不同药物对细胞的毒性作用不同，将药物作用于装置表面不同的细胞培养区；(3)药物作用24h后在培养区滴加CCK-8染色试剂，其可被细胞线粒体内的脱氢酶还原生成黄色甲臜产物，该产物数量与活细胞的数量成正比，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅，因此可根据显色强度间接反应活细胞数量和药物毒性大小；(4)染色2h后的显色结果由手机拍照获得，将得到的图片经过ImageJ软件灰度处理，提取相应的灰度图在RGB色彩模式下B通道的平均值，得到显色强度与不同药物之间的对应关系，颜色越浅，药效越好，从而实现快速药物筛选功能。本专利技术所提供的一种灯芯式纸微流控三维细胞培养纸芯片的制备及药物筛选应用，与现有技术相比，本专利技术将滤纸作为培养细胞的基材，利用其内在的纤维空间结构提供细胞的三维环境培养，体积小且成本低；而且通过简易折叠设计的灯芯式纸柱，利用其毛细作用实现培养基的自主持续供液，使用自动便捷；无需水凝胶的包裹，直接将细胞接种在亲水培养区的纸纤维结构内，后续操作更简单；输出方式采用可视化的显色成像，利用CCK-8的染色原理，显色强度可间接反应活细胞数量及药物毒性，因此最终结果可以通过肉眼识别定性判断药效好坏；通过智能手机结合软件的灰度转化功能还可实现定量分析；而且该纸芯片可设计多个检测区，可以实现高通量检测，提高筛药效率。该专利技术具有成本低廉，操作简便，自动化程度高，生物兼容性好，后续处理简单，结果分析快速等特点，因此在细胞分析、临床诊断及药物筛选等领域具有很好的应用前景。附图说明图1为本专利技术双层纸微流控装置示意图及实物图。图2为本专利技术高通量双层纸微流控装置示意图及实物图。图3为本专利技术微流控装置接种不同细胞量的细胞增殖情况实验结果图。图4为本专利技术微流控装置培养不同天数的细胞增殖情况实验结果图。图5为本专利技术微流控装置化学体外敏感性的实验结果图。图6为本专利技术微流控装置用于筛选不同药物的实验结果图。具体实施方式本专利技术的一种灯芯式纸微流控三维细胞培养纸芯片、制备方法及其在药物筛选中的应用，结合附图对本专利技术的具体实施方案进一步详细说明。实施例中所用仪器和试剂：磷酸盐缓冲液(PBS)、DMEM培养基、FBS胚胎牛血清、胶原蛋白、胰蛋白酶、MCF-7乳腺癌细胞、CCK-8试剂、紫杉醇、芦丁、槲皮素、盐酸阿霉素、DMSO溶剂、去离子水，富士施乐喷蜡打印机，WhatmanNo.1滤纸，WhatmanNo.4滤纸，加热板，CO2培养箱，荧光倒置显微镜，多孔培养板。实施例1——灯芯式纸微流控装置及细胞培养1灯芯式纸微流控三维细胞培养纸芯片的制作：1.1利用Auto-CAD绘图软件分别设计出上层纸芯片和下层纸芯片的图案，并用AI软件中导出。1.2用喷蜡打印机将纸芯片打印出来，上层滤纸采用22μm大孔径的Whatman4号滤纸，下层滤纸采用10μm小孔径的Whatman1号滤纸。1.3裁剪后将含蜡纸芯片烘烤加热2min，使蜡渗透到滤纸的底部，形成疏水的障碍，以此形成纸微流控通道。1.4将上下两层纸芯片对齐后用普通双面胶进行粘贴。1.5根据所需设计不同通量的纸芯片分别用于细胞增殖验证和药物筛选。2.该纸微流控装置上的细胞增殖培养实验2.1为了增加细胞培养的稳定性，细胞接种前在细胞培养区滴加10μL1μg/mL的胶原蛋白，并置于紫外下灭菌2h。2.2折叠灯芯式纸柱，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种灯芯式纸微流控三维细胞培养纸芯片，其特征在于：所述的灯芯式纸微流控三维细胞培养装置由两层印有不同通道的下层纸芯片和上层纸芯片按设计图案对齐后叠加粘贴而构成：/n所述下层纸芯片设置有浸润区，以所述浸润区为起点分别向外延伸出长型流通通道，将所述的长型流通通道的外延端折叠形成灯芯式纸柱，用于培养基的自主持续供液；所述浸润区和流通通道为亲水区，其余区域为疏水区；/n所述的上层纸芯片设置有与下层浸润区相同数量相同图案的细胞培养区，用于细胞接种与培养；所述培养区为亲水区域，其余区域为疏水区；/n上层纸芯片和下层纸芯片对应层叠组装后，上层的每个细胞培养区分别对应覆盖下层的浸润区。/n

【技术特征摘要】
1.一种灯芯式纸微流控三维细胞培养纸芯片，其特征在于：所述的灯芯式纸微流控三维细胞培养装置由两层印有不同通道的下层纸芯片和上层纸芯片按设计图案对齐后叠加粘贴而构成：
所述下层纸芯片设置有浸润区，以所述浸润区为起点分别向外延伸出长型流通通道，将所述的长型流通通道的外延端折叠形成灯芯式纸柱，用于培养基的自主持续供液；所述浸润区和流通通道为亲水区，其余区域为疏水区；
所述的上层纸芯片设置有与下层浸润区相同数量相同图案的细胞培养区，用于细胞接种与培养；所述培养区为亲水区域，其余区域为疏水区；
上层纸芯片和下层纸芯片对应层叠组装后，上层的每个细胞培养区分别对应覆盖下层的浸润区。


2.如权利要求1所述的灯芯式纸微流控三维细胞培养纸芯片，其特征在于，所述的下层纸芯片的流通通道与外延伸段等宽，且外延伸段在与芯片接触处可折叠形成灯芯式纸柱。


3.如权利要求1所述的灯芯式纸微流控三维细胞培养纸芯片，其特征在于，所述的上层纸芯片的细胞接种区设置有多个接种孔，所述接种孔数量可根据所需进行增减。


4.如权利要求1所述的灯芯式纸微流控三维细胞培养纸芯片，其特征在于，所述的下层纸芯片材料和上层纸芯片材料分别为大孔径和小孔径的不同型...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶邦策，左鹏，傅淑霞，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31