一种玉米赤霉烯酮-呕吐毒素双通道免疫定量试纸条制造技术

本发明专利技术公开了一种玉米赤霉烯酮‑呕吐毒素双通道免疫定量试纸条，属于免疫分析快速检测技术领域。本发明专利技术通过标记荧光微球制备荧光探针，包括荧光微球‑玉米赤霉烯酮单克隆抗体、荧光微球‑呕吐毒素单克隆抗体和荧光微球‑羊抗兔二抗，将玉米赤霉烯酮人工抗原、荧光微球人工抗原和羊抗鼠二抗分别喷涂于硝酸纤维素膜作为检测线T1线、检测线T2线和质控线C线制得免疫层析试纸条；利用竞争免疫法，通过读取荧光免疫分析仪上检测线的荧光值，对样品中玉米赤霉烯酮和呕吐毒素同时进行定量分析。该方法不但克服了试纸条技术中胶体金不易保存的缺点，而且制备荧光探针的方法简单高效、灵敏度高。

A double channel immunoassay strip of zearalenone vomit toxin

The invention discloses a double channel immunoquantitative test strip of zearalenone \u2011 vomit toxin, belonging to the technical field of immunoassay rapid detection. In the invention, the fluorescent probe is prepared by labeling the fluorescent microsphere, including the fluorescent microsphere \u2011 zearalenone monoclonal antibody, the fluorescent microsphere \u2011 vomit toxin monoclonal antibody and the fluorescent microsphere \u2011 Goat anti rabbit antibody. The artificial antigen of zearalenone, the artificial antigen of fluorescent microsphere and the second antibody of Goat anti mouse are respectively sprayed on the nitrocellulose membrane as the detection line T1, the detection line T2 and the quality control line The immunochromatographic strip was made by line C, and quantitative analysis of zearalenone and vomit toxin in the sample was carried out simultaneously by reading the fluorescence value of the detection line on the fluorescence immunoanalyzer by competitive immune method. This method not only overcomes the disadvantage of colloidal gold which is difficult to preserve in the paper strip technology, but also makes the fluorescent probe simple, efficient and highly sensitive.

【技术实现步骤摘要】
一种玉米赤霉烯酮-呕吐毒素双通道免疫定量试纸条
本专利技术涉及一种玉米赤霉烯酮-呕吐毒素双通道免疫定量试纸条，属于免疫分析快速检测

技术介绍
玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)，又称F-2毒素，是由禾谷镰刀菌、三线镰刀菌及串珠镰刀菌等产生的一种雌激素类真菌毒素，广泛存在于玉米、小麦、高粱等谷物及其制品中，具有很强的生殖发育毒性和致畸作用，可导致家禽和牲畜的生长缓慢和免疫抑制等，并能够通过食物链进入人体，产生血液和免疫毒性，并且具有致癌活性可导致肿瘤，对人类健康带来巨大危害。呕吐毒素，学名脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，是单端孢菌素烯烃中的一种。其作为一种常见的真菌毒素，主要污染物有小麦、大麦、燕麦、玉米等谷物作物。谷物及其制品在生产过程中可能受到多种产毒真菌毒素的污染，或者感染的真菌能同时产生多种毒素，因此会含有不止一种或者一类真菌毒素。目前同时检测真菌毒素的方法主要是HPLC-MS，但是由于其需要昂贵的设备，复杂的样品前处理等要求，不适合用于快速检测谷物中的真菌毒素，因此亟需开发能够在短时间内同时检测多种真菌毒素的检测方法。目前检测呕吐毒素的试纸条虽有报道，如申请号为201720645327.3、201710319370.5的快速检测卡、201720357308.0的荧光免疫层析试剂盒、201620051794.9的胶体金检测卡，此外，检测玉米赤霉烯酮的试纸条也有报道，如申请号为201720453761.1、20210307321.7的荧光定量快速检测试纸条，但缺少同时检测呕吐毒素和玉米赤霉烯酮的免疫定量试纸条，因此本专利以时间分辨荧光微球为示踪物，根据免疫竞争反应模式建立了一种可以同时检测谷物中玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的双通道免疫层析分析法。每年全球粮食总产量的25％受到真菌毒素的污染。所有的农作物在生长、采后贮藏以及加工时期，都可能会被污染产毒真菌进而含有生物毒素，亟需研究出更加灵敏，更加方便的可用于现场快速、高通量、多通道检测的方法。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述不足，本专利技术提供了一种基于荧光微球标记的同时快速检测玉米赤霉烯酮-呕吐毒素的免疫定量试纸条。本专利技术采用荧光微球替代胶体金，分别用荧光微球标记玉米赤霉烯酮抗体复合物和呕吐毒素抗体复合物，利用竞争免疫法，将其作为荧光探针用于免疫层析，通过读取荧光免疫分析仪上检测线的荧光值，对样品中玉米赤霉烯酮和呕吐毒素同时进行定量分析，可以快速定量检测玉米赤霉烯酮和呕吐毒素。本专利技术第一个目的是提供一种玉米赤霉烯酮-呕吐毒素免疫定量试纸条，所述试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上利用玉米赤霉烯酮人工抗原、呕吐毒素人工抗原和羊抗鼠二抗分别作为检测线T1线、检测线T2线和质控线C线，其中玉米赤霉烯酮人工抗原的用量为0.2-1.6μg/cm，呕吐毒素人工抗原的的用量为0.1-1.2μg/cm。在本专利技术的一种实施方式中，所述检测线T1线、检测线T2线和质控线C线三线之间各自相距0.3-0.5cm。在本专利技术的一种实施方式中，所述NC膜为0.3-1cm左右的宽度切条。优选0.4cm。在本专利技术的一种实施方式中，所述检测线T1线是将0.2-0.8mg/mL玉米赤霉烯酮人工抗原喷涂到NC膜上，每cm的NC膜宽度喷涂量为1-2μL。当NC膜宽度为0.4cm是，喷涂量为0.4-0.8μL。在本专利技术的一种实施方式中，所述检测线T2线是将0.1-0.6mg/mL呕吐毒素人工抗原，喷涂到NC膜上，每cm的NC膜宽度喷涂量为1-2μL。当NC膜宽度为0.4cm是，喷涂量为0.4-0.8μL。在本专利技术的一种实施方式中，所述质控线C线是将0.5-2mg/mL羊抗鼠二抗喷涂到NC膜上，每cm的NC膜宽度喷涂量为1-2μL/cm。当NC膜宽度为0.4cm是，喷涂量为0.4-0.8μL。在本专利技术的一种实施方式中，所述吸水纸、硝酸纤维素膜以及样品垫依次相邻，且相邻部位部分重叠区域的长度为2-4mm。在本专利技术的一种实施方式中，所述吸水纸与硝酸纤维素膜重叠的部分位于硝酸纤维素膜的上侧。在本专利技术的一种实施方式中，还包括包覆所述试纸条的外壳；所述外壳包括底座和卡壳，所述卡壳上有观察口和加样口，以露出试纸条的局部区域；所述加样口开口于所述样品垫上部，以露出部分或全部所述样品垫区域；所述观察口开口于所述硝酸纤维素膜上侧，以露出全部所述检测带和所述质控带。在本专利技术的一种实施方式中，所述试纸条的使用方法包括：(1)将经荧光微球标记(Eu)的玉米赤霉烯酮单克隆抗体(Eu-ZEN-mAb)和呕吐毒素单克隆抗体(Eu-DON-mAb)与玉米赤霉烯酮-呕吐毒素的混标样品混匀，加入到上述试纸条中的样品垫上，进行层析，然后利用免疫定量分析仪分别测定混标样品相应的荧光强度值：T1值、T2值和C值；(2)设置阴性对照，即混标样品中不含有玉米赤霉烯酮和呕吐毒素，利用免疫定量分析仪测得荧光强度T0值；(3)分别取T1/T0、T2/T0作为参数，与浓度的对数值建立线性模型，得到玉米赤霉烯酮和呕吐毒素相应的标准曲线；(4)参照步骤(1)层析待测样品，得到相应的荧光强度值，分别利用步骤(3)所得的两种毒素的标准曲线，即得毒素含量结果。本专利技术的第二个目的是利用上述试纸条提供一种双通道检测玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将经荧光微球标记(Eu)的玉米赤霉烯酮单克隆抗体(Eu-ZEN-mAb)和呕吐毒素单克隆抗体(Eu-DON-mAb)与玉米赤霉烯酮-呕吐毒素的混标样品混匀，加入到上述试纸条中的样品垫上，进行层析，然后利用免疫定量分析仪分别测定混标样品相应的荧光强度值：T1值、T2值和C值；(2)设置阴性对照，即混标样品中不含有玉米赤霉烯酮和呕吐毒素，利用免疫定量分析仪测得荧光强度T0值；(3)分别取T1/T0、T2/T0作为参数，与浓度的对数值建立线性模型，得到玉米赤霉烯酮和呕吐毒素相应的标准曲线；(4)参照步骤(1)层析待测样品，得到相应的荧光强度值，分别利用步骤(3)所得的两种毒素的标准曲线，即得毒素含量结果。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)中的层析时间为10-15min。优选10min。在本专利技术的一种实施方式中，所述混标样品的介质是含10％-40％甲醇的pH值为7.4的PBS溶液。甲醇含量优选20％。在本专利技术的一种实施方式中，将20-50μL的待测样品、40-50μL荧光微球玉米赤霉烯酮抗体复合物(Eu-ZEN-mAb)溶液和40-50μL荧光微球呕吐毒素抗体复合物(Eu-DON-mAb)溶液混合均匀，取混合物100-150μL缓慢滴入试纸条样品垫，35-37℃层析10-15min，然后通过HG-98免疫定量分析仪记录T1值、T2值和C值，用T/T0作为参数，对样品进行定量检测。其中T指加入不同浓度样品时的T1或者T2线处的荧光强度；T0指阴性样品在相应T线处的荧光强度，阴性样品指本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种玉米赤霉烯酮-呕吐毒素双通道免疫定量试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上利用玉米赤霉烯酮人工抗原、呕吐毒素人工抗原和羊抗鼠二抗分别作为检测线T1线、检测线T2线和质控线C线，其中玉米赤霉烯酮人工抗原的用量为0.2-1.6μg/cm，呕吐毒素人工抗原的的用量为0.1-1.2μg/cm。/n

【技术特征摘要】
1.一种玉米赤霉烯酮-呕吐毒素双通道免疫定量试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上利用玉米赤霉烯酮人工抗原、呕吐毒素人工抗原和羊抗鼠二抗分别作为检测线T1线、检测线T2线和质控线C线，其中玉米赤霉烯酮人工抗原的用量为0.2-1.6μg/cm，呕吐毒素人工抗原的的用量为0.1-1.2μg/cm。


2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述检测线T1线、检测线T2线和质控线C线三线之间各自相距0.3-0.5cm。


3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述吸水纸、硝酸纤维素膜以及样品垫依次相邻，且相邻部位部分重叠区域的长度为2-4mm。


4.权利要求1-3任一所述试纸条在检测玉米赤霉烯酮和呕吐毒素中的应用。


5.一种双通道检测玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将经荧光微球标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体Eu-ZEN-mAb和呕吐毒素单克隆抗体Eu-DON-mAb与玉米赤霉烯酮-呕吐毒素的混标样品混匀，加入到权利要求1-3任一所述试纸条中的样品垫上，进行层析，然后利用免疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀兰，李淼，王海鸣，刘莹，纪剑，张银志，孙嘉笛，皮付伟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32