一种检测尿液中同型半胱氨酸的方法技术

本发明专利技术提出了一种检测尿液中同型半胱氨酸浓度的方法。更具体地说，本发明专利技术提出了以同位素内标为校准品，以尿液中肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度差异，结合UPLC‑MS/MS技术检测尿液中同型半胱氨酸浓度的方法。本发明专利技术提供的方法在检测尿液中同型半胱氨酸浓度的同时检测肌酐浓度，由此可以归一化同型半胱氨酸浓度，使得尿液中的同型半胱氨酸能够为评估、诊断或监测心脑血管疾病提供技术基础，并为心脑血管疾病的风险预估和个性化干预提供有效信息和依据。

A method to detect homocysteine in urine

The invention provides a method for detecting the concentration of homocysteine in urine. More specifically, the invention proposes a method for homogenizing the urine concentration difference of different individuals by taking the isotope internal standard as the calibrator, and detecting the concentration of homocysteine in urine by combining the UPLC \u2011 MS / MS technology. The method provided by the invention detects the concentration of creatinine while detecting the concentration of homocysteine in urine, thereby normalizing the concentration of homocysteine, so that homocysteine in urine can provide technical basis for the evaluation, diagnosis or monitoring of cardiovascular and cerebrovascular diseases, and provide effective information and basis for the risk prediction and personalized intervention of cardiovascular and cerebrovascular diseases.

【技术实现步骤摘要】
一种检测尿液中同型半胱氨酸的方法
本专利技术涉及分析化学和医学检测领域，具体地，本专利技术涉及一种基于高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)的快速检测尿液中同型半胱氨酸浓度的方法。
技术介绍
心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液粘稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。研究表明，心脑血管疾病的致病机制可能在于血液的病变，其对人体的损害是隐秘的、逐渐的和全身性的，且早期很难发现明显的临床症状。寻找合理、有效的生物标志物来诊断、分级和指导心脑血管疾病的治疗一直是临床检验诊断学科重点关注的内容。目前已有一系列较为成熟、临床普遍开展的生物标志物检测，为心脑血管疾病的诊断与治疗提供了重要的参考依据。心脑血管疾病的常见指标例如有血清脂质、C反应蛋白(C-reactiveprotein，CRP)和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)。同型半胱氨酸Hcy是蛋白质代谢过程中的降解产物。在正常情况下，血液中的同型半胱氨酸在酶和维生素B6、叶酸的辅助下参与机体转硫基、转甲基过程，并被降解为半胱氨酸，转换为部分蛋白质。当人体的新陈代谢出现障碍时，同型半胱氨酸由于无法降解而在体内聚集。高浓度的同型半胱氨酸会对血管内壁造成损害，使血管内膜增厚、粗糙，形成斑块，进而使管腔狭窄甚至阻塞，动脉供血不全，导致动脉粥样硬化和冠心病的发生。大量研究表明，高的同型半胱氨酸血症是心脑血管疾病的独立危险因素。现有的临床心脑血管疾病血液标志物如同型半胱氨酸、胆固醇、脂质等的检测方法大多采用生化法、免疫法等，方法的特异性和准确度较低，无法满足较高的要求。同时因为要采血，对采样的要求较高，需要专业人员及特定场地才能进行采样。针对上述情况，本专利技术提出了一种尿液沉淀法结合UPLC-MS/MS技术快速精准检测尿液中同型半胱氨酸的方法，为心脑血管疾病的风险预估和个性化干预提供了便利且精准的线索。
技术实现思路
本专利技术提出了一种检测尿液中同型半胱氨酸浓度的方法。更具体地说，本专利技术提出了一种尿液沉淀法结合UPLC-MS/MS技术快速精准检测尿液中同型半胱氨酸浓度的方法。本专利技术检测尿液中同型半胱氨酸浓度的方法以同位素内标为校准品，用尿液中肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度的差异，使用UPLC-MS/MS来检测尿液中的同型半胱氨酸浓度。在第一方面，本专利技术提供了一种检测尿液中同型半胱氨酸的方法，其特征在于，以同位素内标为校准品，以尿液中的肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度的差异，结合UPLC-MS/MS技术检测尿液中同型半胱氨酸的浓度。在第二方面，本专利技术提供了一种检测尿液中同型半胱氨酸浓度的方法，所述方法包括：步骤1，配制样品：1a.配制标品溶液，其包括多个浓度的同型半胱氨酸标品溶液和多个浓度的肌酐标品溶液；1b.配制同位素内标溶液，其包括同型半胱氨酸同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液；步骤2，样品预处理，得到含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样；其中，所述样品预处理包括：2a.向尿液和标品溶液中加入的相应的同位素内标溶液；2b.使尿液和标品溶液经还原剂进行还原；2c.对尿液进行去除蛋白；步骤3，构建标准曲线，其中，将步骤2的含同位素内标的标品溶液进行UPLC-MS/MS测定；步骤4，获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度，其中将步骤2的所述含同位素内标的尿样进行UPLC-MS/MS分析，结合步骤3得到的标准曲线获得同型半胱氨酸浓度和肌酐浓度；获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度。在第三方面，本专利技术提供了一种尿液沉淀法结合UPLC-MS/MS技术快速精准检测尿液中同型半胱氨酸浓度的系统，包括：样品配制模块，所述模块用于配制标品溶液和同位素内标溶液，所述标品溶液为多个浓度的同型半胱氨酸标品溶液和多个浓度的肌酐标品溶液；所述同位素内标溶液为同型半胱氨酸同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液；样品预处理模块，对样品进行预处理，得到含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样，其中，所述样品预处理包括：向标品溶液中加入的相应的同位素内标溶液；使尿液和标品溶液经还原剂进行还原；以及对尿液进行去除蛋白；数据测定模块，其中，将所述含同位素内标的标品溶液进行UPLC-MS/MS测定；将所述含同位素内标的尿样进行UPLC-MS/MS测定；计算模块，用含同位素内标的标品溶液的UPLC-MS/MS结果构建标准曲线，结合含同位素内标的尿样的UPLC-MS/MS结果获得同型半胱氨酸浓度和肌酐浓度；进而获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度。在第四方面，本专利技术提供一种检测尿液中同型半胱氨酸浓度和肌酐浓度的试剂用于制备评估、诊断或监测心脑血管疾病的试剂盒的用途。附图说明图1是同型半胱氨酸标品、未加还原剂的标品溶液中同位素标品同型半胱氨酸二聚体-d8、以及加入还原剂的标品溶液中同位素标品同型半胱氨酸-d4的二级离子质谱图。图2是肌酐标品及其同位素标品肌酐-d3的二级离子质谱图。图3是由五个浓度的同型半胱氨酸同位素内标的标品溶液检测得到的同型半胱氨酸的标准曲线图(上)，以及由四个浓度的肌酐同位素内标的标品溶液检测得到肌酐的标准曲线图(下)。图4是含同位素内标的尿样中同型半胱氨酸(上)和肌酐(下)的MRM质谱图和二级离子质谱图。具体实施方式在本专利技术中，肌酐是肌肉在人体内代谢的产物，主要由肾小球滤过排出体外，因此其浓度与肾功能相关，长期高血压或血性心功能不全会引起肾损伤，进而使肌酐水平升高。每20g肌肉代谢大约可产生1mg肌酐，在肉类食物摄入量稳定时，身体的肌肉代谢又没有大的变化，肌酐的生成就会比较恒定。由此，本专利技术将肌酐用作尿液浓度均一化的重要指标，以排除尿液浓度本身对同型半胱氨酸浓度的差异影响。换句话说，人体尿液中的肌酐浓度被应用于人体尿液中同型半胱氨酸浓度的精准定量，使得能够评估、诊断或监测心脑血管疾病并对其进行及时干预和调节。在第一方面，本专利技术提供了一种检测尿液中同型半胱氨酸的方法，其特征在于，以同位素内标为校准品，以尿液中的肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度的差异，结合UPLC-MS/MS技术检测尿液中同型半胱氨酸的浓度。本专利技术提供的方法能够在检测尿液中同型半胱氨酸浓度的同时检测肌酐浓度，由此可以归一化同型半胱氨酸浓度。在第二方面，本专利技术提供了一种检测尿液中同型半胱氨酸浓度的方法，所述方法包括：步骤1，配制样品：1a.配制标品溶液，其包括多个浓度的同型半胱氨酸标品溶液和多个浓度的肌酐标品溶液；1b.配制同位素内标溶液，其包括同型半胱氨酸同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液；步骤2，样品预处理，得到含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样；其中，所述样品预处理包括：2a.向尿液和标品溶液中加入的相应的同位素内标溶液；2b.使尿液和标品溶液经还原剂进行还原；2c.对尿液进行去除蛋白；步骤3，构建标准曲线，其中，将步骤2的含同位素内标的标品溶液进行UPLC-MS/MS测定；步骤4，获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度，其中将步骤2的所述含同位素内标的尿样进行UPLC-MS/MS分析，结合步骤3得到的标准曲线获得同型半胱氨酸浓度和肌酐浓度；获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度。在一个实施方案中，本专利技术的方法中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测尿液中同型半胱氨酸的方法，其特征在于，以同位素内标为校准品，以尿液中的肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度的差异，结合UPLC‑MS/MS技术检测尿液中同型半胱氨酸的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种检测尿液中同型半胱氨酸的方法，其特征在于，以同位素内标为校准品，以尿液中的肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度的差异，结合UPLC-MS/MS技术检测尿液中同型半胱氨酸的浓度。2.一种检测尿液中同型半胱氨酸的方法，所述方法包括：步骤1，配制样品：1a.配制标品溶液，所述标品溶液为多个浓度的同型半胱氨酸标品溶液和多个浓度的肌酐标品溶液；优选地，多个浓度的同型半胱氨酸标品溶液的数目可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个；优选地，多个浓度的肌酐标品溶液的数目可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个；1b.配制同位素内标溶液，其为同型半胱氨酸同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液；优选地，所述同型半胱氨酸同位素内标为同型半胱氨酸二聚体的氘代化合物，优选同型半胱氨酸二聚体的八氘代化合物；优选地，所述肌酐同位素内标为肌酐的氘代化合物，优选肌酐的三氘代化合物；优选地，所述同位素内标溶液的溶剂为甲醇、甲酸或其混合物的水溶液；步骤2，样品预处理，得到含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样，其中，所述样品预处理包括：2a.向尿液和标品溶液中加入的相应的同位素内标溶液；2b.使尿液和标品溶液经还原剂进行还原；所述还原剂例如为用于还原同型半胱氨酸的分子间或分子内二硫键的化合物，优选为二硫苏糖醇；2c.对尿液进行去除蛋白；优选地，所述去除蛋白包括对所述尿液先进行沉淀得到上清液，然后对所述上清液进行滤除；优选地，所述滤除包括先高速离心，再经0.22μm滤膜过滤所述上清液；步骤3，构建标准曲线，其中将步骤2的含同位素内标的标品溶液进行UPLC-MS/MS测定；步骤4，获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度，其中，将步骤2的所述含同位素内标的尿样进行UPLC-MS/MS分析，结合步骤3得到的标准曲线获得同型半胱氨酸浓度和肌酐浓度；进而获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述尿液选自新鲜尿液、经长期低温冻存的尿液、或干尿液；所述新鲜尿液直接进行检测；经长期低温冻存的尿液地优选在低温冻存前在尿液加入叠氮化钠，优选加入叠氮化钠的量为尿液体积的0.05％至5％，优选为0.1％至2.5％，更优选为1％。4.根据权利要求2所述的方法，其中，在步骤2中，所述沉淀包括在尿液中加入沉淀缓冲液，优选为1ml/L甲酸的乙腈溶液；或者，所述沉淀包括在低温如-15度至-30度，优选在-20度，沉淀约20分钟至数小时，优选为20分钟至1小时，更优选为30分钟。5.一种检测尿液中同型半胱氨酸浓度的系统，所述系统包括：样品配制模块，所述模块用于配制标品溶液和同位素内标溶液，所述标...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊江辉，陈颖，
申请(专利权)人：深圳市绿航星际太空科技研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44