原种事件EE-GM5及在生物样品中用于鉴定该事件的方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供了特定的转基因大豆植物、植物材料和种子，其特征在于这些产品在大豆基因组中的特定位置处携带特定的线虫抗性和除草剂耐受性转化事件。本发明专利技术还提供了工具，这些工具允许快速且明确地鉴定生物样品中的该事件。

Original species event ee-gm5 and methods and kits used to identify the event in biological samples

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】原种事件EE-GM5及在生物样品中用于鉴定该事件的方法和试剂盒相关申请的交叉引用本申请要求于2016年12月22日提交的美国临时申请序列号62/437,874和于2017年4月4日提交的美国临时申请序列号62/481,284的优先权，这些文件的内容通过引用以其全部内容结合在此。
本专利技术涉及新颖的核酸和转基因大豆植物、植物材料、和种子，其特征在于在大豆基因组的特定位置处携带特定的转化事件，特别是赋予线虫抗性和除草剂耐受性的基因的存在。本专利技术的大豆植物将线虫抗性和除草剂耐受性表型与不同遗传背景中的农艺性状、遗传稳定性和功能性相结合，其中在无(一种或多种)HPPD抑制剂型除草剂或线虫侵染情况下所述的遗传背景与相应的非转化大豆遗传背景等同。本专利技术进一步提供了用于鉴定生物样品中植物材料存在的方法和试剂盒，其中所述植物材料特别地包含转化事件EE-GM5。
技术介绍
植物中转基因的表型表达由一个基因或多个基因本身的结构以及它或它们在植物基因组中的位置决定。同时，转基因或“插入的T-DNA”在基因组中不同位置处的存在将以不同方式影响植物的整体表型。通过遗传操作在植物中农业或工业成功地引入商业上的目的性状，取决于不同因素，可以是一个漫长过程。基因转化植物的实际转化和再生只是一系列选择步骤中的第一步，这些步骤包括广泛的遗传表征、基因渗入和田间试验评估，最终导致选择原种事件。鉴于新食品/饲料上的讨论、GMO和非GMO产品的分离、以及专利材料的鉴定，对原种事件的明确鉴定变得越来越重要。理想地，鉴定方法应既快速又简单，无需广泛的实验室设置。此外，该方法应该提供可以允许在没有专家解释的情况下对原种事件实现明确鉴定的结果，但是如果必要的话，该结果也经得起专家审查。种植线虫抗性和除草剂耐受性大豆EE-GM5品种为种植者提供了使用HPPD抑制剂型除草剂(例如，异噁唑草酮(IFT)、苯唑草酮、或硝磺草酮(MST)除草剂)用于线虫和杂草控制的新选择。HPPD抑制剂型除草剂为大豆种植者提供了一种可替代的杂草控制选择，以帮助管理问题杂草物种，并作为替代性作用模式工具，有助于减缓除草剂抗性杂草的蔓延。大豆胞囊线虫(SCN，Heteroderaglycines(Ichinohe)是大豆生产的全球性问题，对生产者持续构成威胁。自1954年在美国北卡罗来纳州的一个县首次发现以来，SCN已经蔓延到美国几乎所有的大豆生产州，并估计导致美国的年产量损失超过12亿美元，成为当地最具破坏性的大豆病原体。SCN于90年代初首次在巴西被发现，目前已经遍布南美洲，并且在巴西是最重要的病原体之一，导致实际上所有巴西种植区域的损失。类似地，SCN持续在中国大豆产区蔓延，其中在15个省份中检测到，产量损失估计超过1.2亿美元。在美国爱荷华州(2001至2015年)进行的一项为期多年的研究，其中几乎所有的SCN抗性大豆品种都含有来自PI88788的SCN抗性，该研究发现SCN群体的毒力逐年增加，导致季末SCN群体密度的增加和具有PI88788来源抗性的SCN抗性大豆品种产量的降低(Mitchum(2016),Phytopathology[植物病理学]106(12):1444-1450,Allen等人.(2017)PlantHealthProgr.[植物健康进展]18:19-27,Arias等人.(2017)www.researchgate.net/publication/266907703_RESISTANCE_TO_SOYBEAN_CYST_NEMATODE_GENETICS_AND_BREEDING_IN_BRAZIL；McCarville等人.(2017)PlantHealthProgress[植物健康进展]18:146-155)。根腐线虫最短尾短体线虫(Pratylenchusbrachyurus)已成为越来越重要的大豆病原体。它具有广泛的寄主范围，并且广泛分布于热带和亚热带地区，特别是巴西、非洲和美国南部。最短尾短体线虫已成为巴西塞拉多(Cerrado)地区棉花和大豆种植者的顾虑，并且被认为是该地区大豆的主要线虫病原体。在大豆中，这种线虫可以使产量降低30％至50％，其中在砂土上观察到更大的损害。抗性大豆品种的使用将是控制该线虫的最佳方式，然而，迄今尚未鉴定出最短尾短体线虫抗性大豆品种。虽然已经研究了针对最短尾短体线虫抗性的若干大豆基因型，并且鉴定了具有耐受性增加的一些栽培品种，但由于这种线虫是杂食性并缺少与其宿主的密切相互作用，因此育种产生针对最短尾短体线虫的抗性栽培品种很难(Machado(2014)CurrentAgriculturalScienceandTechnology[当前农业科学与技术]20:26-35；Antonio等人.(2012)SoilproductivitylossesinareainfestedbythenematoidoftherootlesionsinVera,MT[在Vera，MT中根病变的线虫侵染的区域中土壤生产力的损失].在：BrazilianCongressofSoy[巴西大豆大会],6,2012,Cuiabá.摘要.Londrina:EmbrapaSoja,4pp；Rios等人.(2016)CiênciaRural46:580-584；Lima等人.,2017,在书：Soybean-TheBasisofYield,BiomassandProductivity[大豆——产量、生物量和生产力的基础]中第6章；由MinobuKasai编辑,ISBN978-953-51-3118-2,PrintISBN978-953-51-3117-5,InTech；Inomoto等人.(2011)deculturassobcentralparacontroledefitonematoides:populacional[用于控制植物线虫的中心枢轴下的培养物序列：种群变异],patogenicidadeeestimativadeperdas[致病性和损失估计].TropicalPlantPathology[热带植物病理学]36:178-185)。众所周知，保护植物对抗线虫(例如SCN)可以帮助植物更好地应对其他胁迫(例如，土壤组分/含量、天气条件、病原菌胁迫、除草剂施用等)。特别是当此类其他胁迫产生易于看到的表型时，例如叶子的萎黄/变黄，SCN控制的效果更容易看到，而其他情况下常不“可见”。例如，当大豆植物患有猝死综合征(SDS)或缺铁性萎黄病(IDC)时，针对SCN的保护将导致植物更绿或具有不太严重的SDS/IDC症状。尽管进行了广泛的研究和品种筛选工作，但在美国中北部的大型大豆生产区域，铁缺乏仍然是一个挑战。由于在易受铁缺乏影响的土壤上扩大的大豆生产以及与种植系统变化的可能的相互作用，这一问题的重要性已经增加。铁缺乏发生在具有高pH和碳酸盐的土壤中，但由于与空间可变土壤特性(例如，水分含量、盐度、铁以及其他微量营养素的可用性、和金属浓度)的相互作用，缺铁的表现在空间上变化很大。此外，缺铁表现与生物因子(例如固氮、害虫、疾病)和管理诱导的胁迫(例如，除草剂施用)相互作用。品种选择是管理铁缺乏的最重要的手段，但品种选择由于与萎黄病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸分子，该核酸分子包含与SEQ ID No.1、3或5中任一者的序列或与SEQ ID No.2、4、或6中任一者的序列或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.22 US 62/437,874;2017.04.04 US 62/481,2921.一种核酸分子，该核酸分子包含与SEQIDNo.1、3或5中任一者的序列或与SEQIDNo.2、4、或6中任一者的序列或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列。2.一种核酸分子，该核酸分子包含与SEQIDNo.3、4、5、6、24或25的核苷酸序列或其互补序列具有至少99％序列同一性的核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，该核酸分子包含SEQIDNo.1或3或SEQIDNo.2或4中任一者的核苷酸序列，或所述序列的互补序列，或包含SEQIDNo.1或3和SEQIDNo.2或4的核苷酸序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，该核酸分子包含SEQIDNo.7和9的核苷酸序列或其互补序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子，该核酸分子包含SEQIDNo.11的核苷酸位置188至核苷酸位置7101的核苷酸序列，或与其具有至少98％、或至少99％、或至少99,5％、或至少99,9％序列同一性的核苷酸序列。6.根据权利要求5所述的核酸分子，该核酸分子包含SEQIDNo.5或24和SEQIDNo.6或25的核苷酸序列，或其互补序列。7.一种可从ATCC保藏号PTA-123625下保藏的种子中获得的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNo.1、3、或5中任一者的核苷酸序列以及SEQIDNo.2、4、或6中任一者的核苷酸序列。8.大豆基因组DNA，该大豆基因组DNA包含根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分子。9.一种大豆植物、细胞、植物部分、种子或其子代，该大豆植物、细胞、植物部分、种子或其子代包含根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分子。10.一种大豆植物、细胞、植物部分、种子或其子代，该大豆植物、细胞、植物部分、种子或其子代在基因组中包含SEQIDNo.3的核苷酸序列和SEQIDNo.4的核苷酸序列。11.一种大豆植物、细胞、植物部分、种子或其子代，该大豆植物、细胞、植物部分、种子或其子代在基因组中包含SEQIDNo.5的核苷酸序列和SEQIDNo.6的核苷酸序列，或SEQIDNo.24的核苷酸序列和SEQIDNo.25的核苷酸序列。12.根据权利要求10或11所述的植物、细胞、植物部分、种子或子代，该植物、细胞、植物部分、种子或子代还包含SEQIDNo.7和9的核苷酸序列，或SEQIDNo.23的核苷酸位置1114至核苷酸位置8572的核苷酸序列。13.一种大豆植物、细胞、部分或种子，其各自在其基因组中包含原种事件EE-GM5，其中，所述原种事件是包含插入T-DNA以及紧邻所述插入T-DNA的5’和3’侧翼序列的遗传基因座，该插入T-DNA含有嵌合HPPD-4蛋白编码基因和嵌合Cry14Ab-1蛋白编码基因，所述原种事件与在ATCC保藏号PTA-123625下保藏的参考种子中的相同。14.根据权利要求13所述的植物、细胞、植物部分或种子的子代植物、细胞、植物部分或种子，其中所述子代植物、细胞、植物部分或种子包含SEQIDNo.3的核苷酸序列和SEQIDNo.4的核苷酸序列。15.根据权利要求13或14所述的大豆植物、细胞、部分、或种子，当使用PCR和两个引物分析时，该大豆植物、细胞、部分、或种子的基因组DNA产生84bp的DNA片段，所述两个引物分别包含SEQIDNo.18和SEQIDNo.19的核苷酸序列。16.根据权利要求9至15中任一项所述的植物，该植物对异噁唑草酮、苯唑草酮、或硝磺草酮具有耐受性。17.一种大豆产品，该大豆产品由根据权利要求9至16中任一项所述的大豆植物、细胞、部分、或种子产生。18.根据权利要求17所述的大豆产品，该大豆产品是或包含大豆粕、磨碎的种子、大豆粉、或大豆片。19.根据权利要求17或18所述的大豆产品，其中所述大豆产品包含核酸，该核酸产生对事件EE-GM5具有诊断性或特异性的扩增子。20.一种用于生产大豆产品的方法，该方法包括获得根据权利要求9至16中任一项所述的大豆植物、或细胞、部分、种子或子代，并由此生产该大豆产品。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述大豆产品是或包含大豆粕、磨碎的种子、大豆粉、或大豆片。22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述大豆产品包含核酸，该核酸产生对事件EE-GM5具有诊断性或特异性的扩增子。23.一种用于控制杂草的方法，该方法包括在大豆植物出苗之前但在播种种子之后，用HPPD抑制剂型除草剂处理其中播种了根据权利要求9至16中任一项所述的大豆种子的田地。24.一种用于控制杂草的方法，该方法包括在植物的顶部用HPPD抑制剂型除草剂处理根据权利要求9至16中任一项所述的大豆植物。25.一种用于保护根据权利要求9至16中任一项所述的出苗大豆植物免受杂草竞争的方法，该方法包括：在种植这些大豆植物之前或播种种子之前，用HPPD抑制剂型除草剂处理有待种植所述大豆植物的田地，随后在所述预处理的田地种植或播种所述大豆植物或种子。26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述HPPD抑制剂型除草剂是异噁唑草酮、苯唑草酮、或硝磺草酮。27.一种用于生产对SCN具有抗性和/或对HPPD抑制剂型除草剂具有耐受性的大豆植物的方法，该方法包括，通过将缺少Cry14Ab-1-编码基因和缺少HPPD-4-编码基因的第一大豆植物与根据权利要求9至16中任一项所述的大豆植物杂交，并且选择对SCN具有抗性和/或对HPPD抑制剂型除草剂具有耐受性的子代植物，从而将对SCN的抗性和/或对HPPD抑制剂型除草剂的耐受性引入大豆植物的基因组中。28.根据权利要求9至16中任一项所述的植物、种子、部分、细胞、或其子代用于生产大豆种子的用途。29.根据权利要求9至16中任一项所述的大豆植物或种子用于生长线虫抗性和/或HPPD抑制剂型除草剂耐受性的植物的用途。30.根据权利要求9至16中任一项所述的大豆种子用于获得大豆产品的用途，其中所述大豆产品是或包含磨碎的大豆籽粒、大豆粉、大豆粕、或大豆片。31.一种用于产生包含原种事件EE-GM5的大豆植物或种子的方法，该方法包括将根据权利要求9至16中任一项所述的植物与另一大豆植物杂交，并种植由所述杂交获得的包含EE-GM5的种子。32.一种核酸分子，该核酸分子包含SEQIDNo.11的核苷酸位置131至核苷酸位置7941的核苷酸序列、或与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核酸分子编码杀线虫Cry14Ab蛋白和对HPPD抑制剂具有耐受性的HPPD蛋白。33.根据权利要求32所述的核酸分子，该核酸分子编码SEQIDNo.8的蛋白质或与其具有至少99％同一性的蛋白质，和SEQIDNo.10的蛋白质或与其具有至少99％同一性的蛋白质。34.一种用于在生物样品中鉴定原种事件EE-GM5的方法，该方法包括用特异性引物对或特异性探针检测EE-GM5特异区域，该特异性引物对或特异性探针特异性地识别该区域，所述区域包含EE-GM5中5’或3’T-DNA侧翼区的部分和与其邻接的插入T-DNA的部分。35.适用于EE-GM5特异性检测的引物对，该引物对包含第一引物和第二引物，其中所述第一引物包含序列，所述序列在优化的检测条件下特异性识别在EE-GM5中的插入T-DNA的5’或3’T-DNA侧翼区内的序列；其中所述第二引物包含序列，所述序列在优化的检测条件下特异性识别在EE-GM5中邻接所述侧翼5’或3’区域的插入T-DNA内的序列；所述5’T-DNA侧翼区包含SEQIDNo.5的核苷酸1至核苷酸166的核苷酸序列或SEQIDNo.24的核苷酸1至核苷酸1113的核苷酸序列，所述3’T-DNA侧翼区包含SEQIDNo.6的核苷酸359至核苷酸691的互补序列的核苷酸序列或SEQIDNo.25的核苷酸359至核苷酸1449的互补序列的核苷酸序列，所述插入T-DNA包含SEQIDNo.5的核苷酸167至核苷酸353的核苷酸序列的互补序列、或SEQIDNo.6的核苷酸1至核苷酸358的核苷酸序列、或SEQIDNo.11的核苷酸位置1至核苷酸位置7459的核苷酸序列或其互补序列、或SEQIDNo.23的核苷酸1114至核苷酸8572的核苷酸序列或其互补序列。36.根据权利要求35所述的引物对，其中所述第一引物包含选自以下的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列：SEQIDNo.5的核苷酸1至核苷酸166的核苷酸序列、或SEQIDNo.24的核苷酸1至核苷酸1113的核苷酸序列、或其互补序列，或所述第一引物包含选自以下的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列：SEQIDNo.6的核苷酸358至核苷酸691的核苷酸序列、或SEQIDNo.25的核苷酸359至核苷酸1449的核苷酸序列、或其互补序列，并且其中所述第二引物包含选自以下的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列：SEQIDNo.5的核苷酸167至核苷酸353的核苷酸序列或其互补序列、或SEQIDNo.6的核苷酸1至核苷酸358的核苷酸序列或其互补序列、或SEQIDNo.11的核苷酸位置1至核苷酸位置7459的核苷酸序列或其互补序列、或SEQIDNo.23的核苷酸1114至核苷酸8572的核苷酸序列或其互补序列。37.根据权利要求35所述的引物对，其中所述第一引物在其最3’端包含选自以下的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列：SEQIDNo.5的核苷酸1至核苷酸166的核苷酸序列或SEQIDNo.24的核苷酸1至核苷酸1113的核苷酸序列、或其互补序列，或所述第一引物在其最3’端包含选自以下的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列：SEQIDNo.6的核苷酸358至核苷酸691的核苷酸序列、或SEQIDNo.25的核苷酸359至核苷酸1449的核苷酸序列、或其互补序列，并且其中所述第二引物在其最3’端包含选自以下的至少17个连续核苷酸：SEQIDNo.5的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·莫泽，M·布伊斯，F·斯拉宾克，V·贝林松，T·克莱文，J·多姆，W·阿尔特森，V·哈贝克斯，M·麦卡维尔，
申请(专利权)人：巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US