一种定位脂滴检测硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种检测硫化氢的荧光探针：

A fluorescent probe for the detection of hydrogen sulfide in lipid droplets and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种定位脂滴检测硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术属于分析化学
，具体涉及一种检测硫化氢和脂滴的荧光探针及其制备方法和应用。
技术介绍
硫化氢是一种无机化合物，正常情况下是一种无色、易燃的酸性气体，浓度低时带恶臭，气味如臭蛋；浓度高时反而没有气味(因为高浓度的硫化氢可以麻痹嗅觉神经)。它能溶于水，是一种弱酸，当它受热时，硫化氢又从水里逸出。硫化氢(H2S)是继一氧化碳和一氧化氮之后，第三种可在生命体内发挥生理作用的内源性气体信号分子。硫化氢是一种急性剧毒，吸入少量高浓度硫化氢可于短时间内致命。低浓度接触仅有呼吸道及眼的局部刺激作用，高浓度时全身作用较明显，表现为中枢神经系统症状和窒息症状。该气体分子在心血管和神经系统中担负着重要的生理病理调节作用。因此，设计并合成特异性好、灵敏度高、并具有良好的生物相容性的荧光探针，能够实时准确地对生物体内的硫化氢浓度进行检测和成像对于疾病的预防、诊断、检测、治疗以及病理生理的深入研究都具有重要的指导意义。目前，主要通过分光光度法、电化学检测法、气相色谱法、液相色谱法等检测手段来检测硫化氢。这些方法一般适用于检测水溶液和食品中的硫化氢，并不适于生物环境的硫化氢的检测，因为它们的检测灵敏度有限并且对生物样品具有破坏性。快速检测、易观查信号变化的硫化氢荧光探针是非常有必要的。脂滴是一个重要的亚细胞器，在细胞中起着不可或缺的作用，例如，细胞膜形成，脂蛋白形成和细胞内信号转导。脂滴主要由中性脂质组成，包括三酰基甘油和胆固醇酯，表面被单层磷脂覆盖，膜蛋白嵌入在上面。脂滴不仅存在于脂肪细胞中，而且普遍存在于从细菌细胞到哺乳动物细胞的大多数细胞中。脂肪酸的储存和消耗受到严格调节，如果脂滴在这种调节中的失衡就会导致代谢紊乱如肥胖和糖尿病。因此，脂滴的实时动态监测也是目前重要的研究方向。近年来，小分子有机荧光探针受到科学界的广泛关注，它与特定目标分析物发生作用后，荧光信号会发生变化，以达到检测的目的。利用荧光探针的荧光分析法具有特异选择性、高灵敏度、响应时间快等特征，并且对细胞内目标分子进行非侵入性成像检测可以实时监测，形象具体地观察到信号变化。所以专利技术能同时检测H2S和脂滴的荧光探针是非常重要的。
技术实现思路
针对现有技术中的问题，本专利技术提供一种检测硫化氢和脂滴的荧光探针，响应速度快、抗干扰能力强。本专利技术的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测溶液中或生物细胞内硫化氢的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种检测硫化氢的荧光探针，简称H-LDS，其化学结构式如式(I)所示：上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：(1)在N2保护下，4-溴-1，8-萘酸酐与NaN3在K2CO3催化下于DMF中加热反应，分离提纯得化合物2；(2)步骤(1)所得化合物2与氨丙基二硅氧烷于乙醇中，避光加热反应，分离纯化得荧光探针H-LDS。步骤(1)中，所述物料4-溴-1，8-萘酸酐与NaN3物质的量比为：1:1.5。步骤(1)中，所述反应时间为2h。步骤(1)中，所述加热温度为45℃。步骤(1)中，所述分离提纯步骤为将反应液倒入冰水中，抽滤烘干，以纯二氯甲烷为洗脱剂进行柱层析纯化，用旋转蒸发仪除去二氯甲烷。步骤(2)中，所述化合物2与氨丙基二硅氧烷物质的量比为2:1。步骤(2)中，所述反应时间为4h。步骤(2)中，所述加热温度为65℃。步骤(2)中，所述分离提纯步骤为除去反应液中的乙醇，用硅胶层析柱以体积比为30:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂，纯化得到化合物3。一种上述荧光探针在检测溶液、细胞或生物体中硫化氢和脂滴的应用。本专利技术的机理如下：本专利技术的荧光探针H-LDS主链同时具有Si-O-Si及萘酰亚胺结构，荧光探针和硫化氢反应，将叠氮基团还原成氨基，在550nm处的荧光增强。探针中由于存在硅氧烷结构，容易在脂滴中富集，当没有H2S存在的时候探针在脂滴中并不会有荧光存在，当H2S存在的时候探针在脂滴中显示出绿色荧光。本专利技术具有以下优点：本专利技术的荧光探针可用于检测溶液、细胞和生物体内的硫化氢。响应速度快，稳定性高，检测硫化氢时，15min达到稳定状态；抗干扰性强。同时，该荧光探针还可用于定位细胞脂滴。附图说明图1是荧光探针H-LDS的1HNMR图谱；图2是荧光探针H-LDS的13CNMR图谱；图3荧光探针H-LDS的离子选择性的荧光光谱图；图4荧光探针H-LDS在不同浓度H2S条件下的荧光光谱图；图5荧光探针H-LDS对H2S的时间响应荧光谱图；图6荧光探针H-LDS在细胞中对H2S的响应图；图7荧光探针H-LDS在细胞中对脂滴的定位图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1荧光探针H-LDS的合成(1)将4-溴-1，8-萘酸酐(1.2g，4mmol、)溶解于15mlDMF中，随后加入NaN3(0.4g，6mmol)，加入催化量的K2CO3，在N2保护下避光45℃加热至回流搅拌反应2小时；然后将反应液倒入冰水中，抽滤烘干，用硅胶层析柱以纯二氯甲烷为洗脱剂进一步纯化，用旋转蒸发仪除去二氯甲烷，得化合物2。(2)称取步骤(1)所得化合物2(0.524g，2mmol)溶于乙醇中，随后加入氨丙基二硅氧烷(0.249g，1mmol)，避光68℃加热回流搅拌反应4h，然后除去反应液中的乙醇，用硅胶层析柱以体积比为30:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂进一步纯化得到化合物3，所得化合物3即荧光探针H-LDS。其1HNMR图谱如图1，13CNMR图谱如图2。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.67–8.60(m,3H),8.47–8.40(dd,J＝20.1,8.4Hz,2H),8.12(d,J＝8.5Hz,1H),7.79–7.67(m,1H),7.46(dd,J＝23.0,8.0Hz,2H),6.90(d,J＝8.5Hz,1H),4.22–4.09(m,4H),2.67(t,J＝7.0Hz,2H),0.71–0.61(m,4H),0.55–0.47(m,2H),0.06(s,12H).13CNMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm):163.9,163.5,143.4,132.1,131.7,129.2,128.7,126.8,124.3,45.4,27.7,15.36,0.32实施例2荧光探针H-LDS离子选择性的荧光光谱配制1mmol实施例1所得荧光探针的乙醇溶液母液备用。取10ul探针母液溶于3mlPBS和乙醇的混合溶液(25μMPBSbuff，pH＝7.4，10％乙醇)，然后取20当量的各种离子液(1、探针；2、Cys、3、D-Cys；4、EtOONH4；5、Glu；6、Gly；7、kNO3；8、NaNO2；9、Na2S2O3；10、NaBr；11、NaCl；12、NaClO；13、NaCNS；14、NaF；15、NaHCO3；16、NaI；17、Na2SO3；18、Na2SO4；19、Na2CO3；20、Na2S2O4；21、NaHS)入到混合液中，充分反应后，用荧光分光光度计测试其荧光性能(λex＝405nm，狭缝宽度：激发5mm,发射2.5mm)。荧光光谱如图3所示。由图3可知，当探针加入其它离子的时候在550nm荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测硫化氢的荧光探针，其化学结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种检测硫化氢的荧光探针，其化学结构式为：。2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在N2保护下，4-溴-1，8-萘酸酐与NaN3在K2CO3催化下于DMF中加热反应，分离提纯得化合物2：；（2）步骤（1）所得化合物2与氨丙基二硅氧烷于乙醇中，避光加热反应，分离纯化得荧光探针。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述物料4-溴-1，8-萘酸酐与NaN3物质的量比为1:1.5；所述化合物2与氨丙基二硅氧烷物质的量比为2:1。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，王小妮，左育静，张宇，杨婷新，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37