检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂的应用和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂的应用和试剂盒，涉及基因检测技术领域。本发明专利技术公开的试剂盒其包括用于检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂，其通过对SDC2基因和TFPI2基因中的特定区域进行甲基化检测，将这些区域的甲基化检测结果作为结直肠癌辅助诊断的依据，具有更高灵敏度和特异性，为结直肠癌或结直肠腺瘤的早期筛查、诊断等提供更加准确、可靠的参考依据。

【技术实现步骤摘要】
检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂的应用和试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，具体而言，涉及检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂的应用和试剂盒。
技术介绍
结直肠癌是世界第三大恶性肿瘤。中国近年来结直肠癌发病率逐年上升，估计每年约有40万新发病例，在我国消化系统恶性肿瘤中位列第二。结直肠癌通常由癌前息肉经过一系列遗传学和表观遗传学改变及组织学与形态学的变化缓慢发展而来，大多数结直肠肿瘤生长缓慢、保持沉默或无症状，直到它们达到了一定的大小或发展阶段。因此，结直肠癌是可以通过筛查进行干预的理想靶标。早期结直肠癌患者手术5年生存率可高达90％以上，中、晚期患者5年生存率仅10％左右，而临床诊断的结直肠癌约80％为中晚期，这是导致其死亡率居高不下的关键因素之一。经有效治疗的早期结直肠癌患者其发病率降低60％，病死率降低80％，因此结直肠癌的早期发现、早期诊断及早期治疗显得尤为重要。结直肠癌的形成机制非常复杂，其癌变过程是多步骤、多途径、多基因参与的结果。原癌基因、抑癌基因的突变与甲基化、增殖凋亡等信号通路分子的改变都在结直肠癌的发生发展中起着重要作用。肠镜检查是结直肠癌检测和确诊的金标准，但因其需要复杂的肠道准备过程、具有一定的侵入性且需要专业的技术人员，因此在一般人群中的普及率不高。无创检测方法如粪便潜血检查(FOBT)和粪便免疫化学检查(FIT)的灵敏度不高，尤其是在检测I期结直肠癌和进展期腺瘤方面灵敏性较低。因此结直肠癌及癌前病变的检测亟需一种高灵敏性和特异性的无创检测方法。甲基化是一种表观遗传修饰，其异常变化可引起DNA构象及DNA与蛋白质相互作用方式等发生改变，从而控制基因表达。DNA甲基化在基因表达调控、细胞增殖分化、发育和基因印记等方面起着重要作用，与肿瘤的发生与发展有密切关系。越来越多的研究表明，DNA甲基化异常是癌症发生的早期事件，在结直肠癌发生和发展中存在DNA甲基化水平和模式的改变，寻找特异性的甲基化片段，对结直肠癌的早期检测起到决定性的作用。现有结直肠癌相关的甲基化检测技术存在操作步骤繁琐、检测灵敏性不高等突出问题。例如现有技术CN105543354A利用甲基化特异性PCR(MSP)检测SDC2基因的甲基化。该方法存在的问题和缺点是：该专利使用46例结直肠癌、46例结直肠腺瘤和46例正常粪便样本进行SDC2甲基化检测，结果显示SDC2对结直肠癌对癌症的检测灵敏度较低，只有87％。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂的应用和试剂盒。本专利技术的试剂盒以不同结直肠癌相关基因的不同检测区域作为甲基化的检测靶区域，可以显著提高检测的灵敏度和特异性，以实现早期、快速、准确检测结直肠癌和结直肠腺瘤的目的。本专利技术是这样实现的：第一方面，本专利技术实施例提供用于检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用，上述结直肠癌相关基因选自SDC2基因和TFPI2基因中的一种和两种的组合；上述检测试剂包括用于检测SDC2基因上的第一靶区域甲基化的第一试剂或/和用于检测TFPI2基因上的第二靶区域甲基化的第二试剂；其中，上述第一靶区域选自SDC2基因的如下区域中的任意一种或几种的组合：区域a、区域b和区域c；其中，区域a选自chr8:96493351-96493635的全长区域或部分区域，区域b选自chr8:96493701-96493935的全长区域或部分区域，区域c选自chr8:96494006-96494335的全长区域或部分区域；上述第二靶区域选自TFPI2基因的如下区域中的任意一种或几种的组合：区域d和区域e；其中，区域d选自chr7:93890026-93890319的全长区域或部分区域，区域e选自chr7:93890630-93890991的全长区域或部分区域。本专利技术的研究发现，检测的灵敏度和特异性等与目标基因的检测区域密切相关，主要是因为在整个较长的基因及其调控序列中，差异化的甲基化区域(DMR)仅占很小的一部分，只有当特异性地检测这一小部分DMR时，才能对样本具有较好的区分度，大大提高检测灵敏度和特异性。本专利技术的研究发现，以结直肠癌相关基因如SDC2基因或TFPI2基因作为检测的靶基因，来辅助诊断结直肠癌或癌前病变时，选择SDC2基因中的chr8:96493351-96493635的全长区域或部分区域、chr8:96493701-96493935的全长区域或部分区域和chr8:96494006-96494335的全长区域或部分区域三个区域中的任意一种或几种的组合作为甲基化检测的靶区域，或者是选择TFPI2基因的chr7:93890026-93890319的全长区域或部分区域和chr7:93890630-93890991全长区域或部分区域中的任意一种或两种的组合作为甲基化检测的靶区域，又或者是将上述选自SDC2基因的靶区域和上述选自TFPI2基因的靶区域组合作为甲基化检测的靶区域，都可以显著提高结直肠癌辅助诊断的灵敏度和特异性，为结直肠癌或结直肠腺瘤的早期筛查、诊断等提供更加准确、可靠的参考依据。SDC2基因的位置为：Chromosome8，NC_000008.11(96493601-96611790)，启动子区域一般位于转录起始位点的上游。TFPI2基因的位置为：Chromosome7，NC_000007.14(93885396-93890753,complement)，启动子区域一般位于转录起始位点的上游。在可选的实施方式中，上述区域a选自chr8:96493393-96493629的全长区域或部分区域。在可选的实施方式中，上述区域b选自chr8:96493701-96493900的全长区域或部分区域。在可选的实施方式中，上述区域c选自chr8:96494006-96494327的全长区域或部分区域。在可选的实施方式中，上述区域a选自chr8:96493393-96493581和chr8:96493456-96493629中的任意一种。在可选的实施方式中，上述区域b选自chr8:96493701-96493858和96493770-96493900中的任意一种。在可选的实施方式中，上述区域c选自chr8:96494006-96494166和chr8:96494140-96494327中的任意一种。在可选的实施方式中，上述区域a选自chr8:96493456-96493581。在可选的实施方式中，上述区域b选自96493770-96493858。在可选的实施方式中，上述区域c选自chr8:96494140-96494166。在可选的实施方式中，上述区域d选自chr7:93890026-93890312的全长区域或部分区域。在可选的实施方式中，上述区域e选自chr7:93890651-93890976的全长区域或部分区域。在可选的实施方式中，上述区域d选自chr7:93890026-93890176和chr7:93890149-93890312中的任意一种。在可选的实施方式中，上述区域e选自chr7:93890651-93890825和chr7:93890807-93890976中的任意一种。在可选的实施方式本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述结直肠癌相关基因选自SDC2基因和TFPI2基因中的一种和两种的组合；所述检测试剂包括用于检测SDC2基因上的第一靶区域甲基化的第一试剂或/和用于检测TFPI2基因上的第二靶区域甲基化的第二试剂；其中，所述第一靶区域选自SDC2基因的如下区域中的任意一种或几种的组合：区域a、区域b和区域c；其中，区域a选自chr8:96493351‑96493635的全长区域或部分区域，区域b选自chr8:96493701‑96493935的全长区域或部分区域，区域c选自chr8:96494006‑96494335的全长区域或部分区域；所述第二靶区域选自TFPI2基因的如下区域中的任意一种或几种的组合：区域d和区域e；其中，区域d选自chr7:93890026‑93890319的全长区域或部分区域，区域e选自chr7:93890630‑93890991的全长区域或部分区域。

【技术特征摘要】
1.用于检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述结直肠癌相关基因选自SDC2基因和TFPI2基因中的一种和两种的组合；所述检测试剂包括用于检测SDC2基因上的第一靶区域甲基化的第一试剂或/和用于检测TFPI2基因上的第二靶区域甲基化的第二试剂；其中，所述第一靶区域选自SDC2基因的如下区域中的任意一种或几种的组合：区域a、区域b和区域c；其中，区域a选自chr8:96493351-96493635的全长区域或部分区域，区域b选自chr8:96493701-96493935的全长区域或部分区域，区域c选自chr8:96494006-96494335的全长区域或部分区域；所述第二靶区域选自TFPI2基因的如下区域中的任意一种或几种的组合：区域d和区域e；其中，区域d选自chr7:93890026-93890319的全长区域或部分区域，区域e选自chr7:93890630-93890991的全长区域或部分区域。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述区域a选自chr8:96493393-96493629的全长区域或部分区域；优选地，所述区域b选自chr8:96493701-96493900的全长区域或部分区域；优选地，所述区域c选自chr8:96494006-96494327的全长区域或部分区域；优选地，所述区域a选自chr8:96493393-96493581和chr8:96493456-96493629中的任意一种；优选地，所述区域b选自chr8:96493701-96493858和96493770-96493900中的任意一种；优选地，所述区域c选自chr8:96494006-96494166和chr8:96494140-96494327中的任意一种；优选地，所述区域a选自chr8:96493456-96493581；优选地，所述区域b选自chr8:96493770-96493858；优选地，所述区域c选自chr8:96494140-96494166。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述区域d选自chr7:93890026-93890312的全长区域或部分区域；优选地，所述区域e选自chr7:93890651-93890976的全长区域或部分区域；优选地，所述区域d选自chr7:93890026-93890176和chr7:93890149-93890312中的任意一种；优选地，所述区域e选自chr7:93890651-93890825和chr7:93890807-93890976中的任意一种；优选地，所述区域d选自chr7:93890149-93890176；优选地，所述区域e选自chr7:93890807-93890825。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌相关基因为SDC2基因和TFPI2基因的联合；所述检测试剂包括用于检测SDC2基因上的第一靶区域甲基化的第一试剂和用于检测TFPI2基因上的第二靶区域甲基化的第二试剂；所述第一靶区域为区域c；所述第二靶区域为区域d。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述第一试剂包括用于检测所述第一靶区域甲基化的第一核酸组，所述第一核酸组包括荧光探针c和引物对c的组合或荧光探针c1和引物对c1的组合；所述第二试剂包括用于检测所述第二靶区域甲基化的第二核酸组，所述第二核酸组包括引物对d与荧光探针d的组合或引物对d1与荧光探针d1的组合；其中，所述引物对c的碱基序列如SEQIDNO.11-12所示，所述荧光探针c的碱基序列如SEQIDNO.13所示；所述引物对c1的碱基序列如SEQIDNO.14-15所示，所述荧光探针c1的碱基序列如SEQIDNO.16所示；所述引物对d的碱基序列如SEQIDNO.17-18所示，所述荧光探针d的碱基序列如SEQIDNO.19所示；所述引物对d1的碱基序列如SEQIDNO.20-21所示，所述荧光探针d1的碱基序列如SEQIDNO.22所示；优选地，所述试剂盒的检测样本为取自待测主体的血液样本、结直肠组织样本或粪便样本。6.一种结直肠癌辅助诊断试剂盒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：张良禄，李婷婷，董兰兰，吴志诚，姚希辉，陈玉珠，
申请(专利权)人：武汉艾米森生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42