一种泰斯巴汀类似物的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种泰斯巴汀类似物的制备方法，其包含以下步骤(1).如下式(式I)所示前体肽1或前体肽2在硫酯酶催化下，所述前体肽第8位的D‑Thr或D‑Ser与第11位的氨基酸发生缩合反应即得。还公开了一种用于制备泰斯巴汀类似物的试剂盒，所述的试剂盒含如式I所示的前体肽1或前体肽2。本发明专利技术公开了一种前体肽，所述前体肽如式I所示的前体肽1或前体肽2。还公开了所述前体肽在制备合成泰斯巴汀类似物的试剂盒中的应用。本发明专利技术泰斯巴汀类似物的制备方法快速、高效，可用于大规模构建抗菌活性化合物，并建立泰斯巴汀类似物库，以筛选更有药物价值的化合物。

Preparation and application of a kind of terbutine analogue

【技术实现步骤摘要】
一种泰斯巴汀类似物的制备方法及其应用
本专利技术属于化学与生物技术工程领域，涉及一种泰斯巴汀类似物的制备方法及其应用。
技术介绍
天然产物，尤其是微生物来源的天然化合物，一直是抗生素类药物发现或发展的源泉，如抗感染药物青霉素的发现就是一个非常好的例子。但随着抗生素使用的不规范，以及细菌抗性基因进化等原因，细菌耐药性已经越来越成为一个危害公众健康的巨大隐患，目前市场上的商业化抗生素多来源于上世纪中期——抗生素发现的黄金年代，但它们在应对细菌耐药性问题上已越来越无能为力，急需发现新型的抗生素药物。泰斯巴汀(Teixobactin)是近30年来发现的第一种新型抗生素，它具有新型的骨架，是一类含有十一个氨基酸残基的非核糖体多肽，具有非常好的抗菌活性(图1)。研究表明，它可以杀死一些臭名昭著的耐药性革兰氏阳性致病菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)等，且效果非常显著。实验室研究结果表明，目前使用多种手段，仍未培养出抗泰斯巴汀的耐药致病菌，这表明其具有独特的抗菌机制，可以用来对抗日益严峻的细菌耐药性问题。同时泰斯巴汀未表现出明显的细胞毒性，这些优点都使得其受到广泛关注，并具有开发成临床使用药物的巨大潜力。由于泰斯巴汀巨大的药物开发潜力，很多化学、生物、医药界的工作者都将目光聚焦到它的研究上。很多有机合成化学家，进行了巨大的努力，对其进行了全合成工作，并得到了各种类似物。然而，由于泰斯巴汀复杂的化学结构，使得通过化学合成的方法生产泰斯巴汀及其类似物的前景有限。例如，CN106632604A公开了一种泰斯巴汀类似物及其制备方法，其包括在固相合成树脂上制备直链肽，用CH2Cl2洗涤树脂进行环化，抽除CH2Cl2，加入无水DMF、吡啶、醋酸铜，过夜震荡，然后用半制备型HPLC纯化，收集产物，冷冻干燥，得到环化产物。其方法非常复杂，操作步骤繁琐，制备时间长，且不利于一次性快速大量制备多个不同的化合物。另外，其制备中使用大量化学试剂造成环境污染，不利于工业推广。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏一种快速、简单、高效且大量制备泰斯巴汀(Teixobactin)类似物的制备方法的缺陷，提供一种泰斯巴汀类似物的制备方法及其应用。所述制备方法可用于建立泰斯巴汀类似物库，以筛选更有药物价值的化合物。为解决这一技术问题，本专利技术的技术方案之一为，一种泰斯巴汀类似物的制备方法，其包含以下步骤：(1).如下式(式I)所示前体肽1或前体肽2在硫酯酶催化下，所述前体肽第8位的D-Thr或D-Ser与第11位的氨基酸发生缩合反应即得。在式I的前体肽硫酯酶缩合反应中，第8位的D-Ser/Thr的羟基通过进攻11位的L-Ile的酯基成环。优选地，还包括步骤(2).使所述硫酯酶失活，离心并收集上清。更优选地，还包括步骤(3).将步骤(2)所得的产物冻干，获得干粉。硫酯酶(thioseterase,TE)是属于酯酶家族的酶，在巯基上表现出酯酶活性，可催化脂肪酸链的终止作用，水解脂酰基-S-酰基载体蛋白的硫酯键，释放自由脂肪酸的酶。优选地，所述硫酯酶(thioseterase,TE)的终浓度为2～20μM，缩合反应的温度为25～35℃，且pH为7.5～8.0。更优选地，所述硫酯酶的终浓度为2μM；所述的温度为30℃；所述的pH为8.0。所述缩合反应的反应时间优选为30min，反应体系为50mM的MOPS溶液。进一步更优选地，所述离心的速度为11,000×g，时间为10min。优选地，所述硫酯酶失活是通过加入2倍反应体积的甲醇，或在55～65℃中水浴10～30min实现的。更优选地，所述硫酯酶为含硫酯酶模块的非核糖体聚肽合酶(nonribosomalpeptidesynthetase,NRPS)。非核糖体肽合成酶是一类多功能蛋白质复合体，其独立于信使RNA，能识别、激活、转运氨基酸底物并按特定顺序合成非核糖体肽。NRPS构成天然生物活性产物的一大类，是细菌和霉菌等的次级代谢产物，具有结构多样性和重要的药用价值。目前发现的NRPS在微生物体内可能作为抗生素、铁载体、毒素、含氮物质的储存场所及调节生长等的信号分子等发挥各种功能。最优选地，所述硫酯酶模块为TE1-TE2；所述TE1-TE2其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术中的硫酯酶模块，首先采用在线的NRPS合成模块预测工具——PKS/NRPSAnalysis，对来源于β-变形杆菌Eleftheriaterrae的泰斯巴汀生物合成基因进行分析，得到其生物合成途径中编码的两个连续的硫酯酶模块(TE1-TE2，图2)，并按照氨基酸序列进行大肠杆菌表达密码子优化，设计出编码基因，所述的硫酯酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。上述核苷酸序列交金唯智公司进行合成，并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a上。最后将这一编码了合成泰斯巴汀所使用的硫酯酶模块的质粒导入到大肠杆菌表达菌株BL21中，进行异源表达并纯化。使用pET28a表达载体，可以得到N端带有六个连续组氨酸标签的蛋白，这使得后续蛋白质的纯化只需使用商业化可得的镍柱，就可以得到足够反应使用的硫酯酶模块。同样地，其它常规带标签的载体也可用于本专利技术。为解决这一技术问题，本专利技术的技术方案之一为，一种用于制备泰斯巴汀类似物的试剂盒，所述的试剂盒含如式I所示的前体肽1或前体肽2。优选地，所述试剂盒还包括氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的硫酯酶TE1-TE2。为解决这一技术问题，本专利技术的技术方案之一为，一种前体肽，所述的前体肽如下式(式I)所示的前体肽1或前体肽2。泰斯巴汀的前体肽合成，采用传统的固相合成技术，从羧基端(C端)倒数第二个氨基酸开始，将其与活化好的树脂连接，随后使用Fmoc保护的氨基酸作为原料，经过脱保护、缩合两个步骤，逐步延伸肽链至氨基端(N端)第一个氨基酸，在酸性条件下，水解释放合成好的多肽，并在水相中将其与C端的最后一个被甲酯化的氨基酸缩合连接，经高效液相色谱(HPLC)分离纯化，得到前体肽。为解决这一技术问题，本专利技术的技术方案之一为，所述前体肽在制备合成泰斯巴汀类似物的试剂盒中的应用。为解决这一技术问题，本专利技术的技术方案之一为，一种泰斯巴汀类似物，所述泰斯巴汀类似物如下式(式II)所示的泰斯巴汀类似物1或泰斯巴汀类似物2。本专利技术在前体肽的合成及硫酯酶模块的表达中，使用的策略均是常规、成熟的方法，便于重复操作及应用。本专利技术中得到的泰斯巴汀类似物，其具体实施方式将在下文详细说明，其结构经高分辨串级质谱(HR-MS-MS)进行鉴定确认。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于：本专利技术提供了快速、高效、大规模构建抗菌活性化合物泰斯巴汀类似物的制备方法，其可用于建立泰斯巴汀类似物库，以筛选更有药物价值的化合物。附图说明图1为泰斯巴汀的化学结构，其是一个含有11个氨基酸残基的缩酯环肽，第10位的氨基酸(L-allo-enduracididine)是一个独特的非蛋白质氨基酸；图2为泰斯巴汀生物合成基因簇中的两个非核糖体多肽合成酶及其包含的各功能域，通过软件预测，其中每个包含的功能域与泰斯巴汀的化学结构相匹配，值得注意的是，txo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种泰斯巴汀(Teixobactin)类似物的制备方法，其特征在于，其包含以下步骤：(1).如下式(式I)所示前体肽1或前体肽2在硫酯酶催化下，所述前体肽第8位的D‑Thr或D‑Ser与第11位的氨基酸发生缩合反应即得。

【技术特征摘要】
1.一种泰斯巴汀(Teixobactin)类似物的制备方法，其特征在于，其包含以下步骤：(1).如下式(式I)所示前体肽1或前体肽2在硫酯酶催化下，所述前体肽第8位的D-Thr或D-Ser与第11位的氨基酸发生缩合反应即得。2.如权利要求1所述的制备方法，其还包括步骤(2).使所述硫酯酶失活，离心并收集上清；优选地，还包括步骤(3).将步骤(2)所得的产物冻干，获得干粉。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述硫酯酶的终浓度为2～20μM，缩合反应的温度为25～35℃，且pH为7.5～8.0；优选地，所述硫酯酶的终浓度为10μM，所述的温度为30℃，且所述的pH为8.0。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述离心的速度为11,000×g，时间为10min。5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琪，
申请(专利权)人：南京凯沫比尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32