一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建方法，包括以下步骤：先将EGFP基因融合到MT1‑MMP基因的C端，得到表达MT1‑MMP‑EGFP的病毒载体；将表达MT1‑MMP‑EGFP的病毒载体与病毒包装质粒一起共转染到受体细胞中进行病毒包装，得到含有表达MT1‑MMP‑EGFP的病毒的上清液，然后用其侵染黑色素瘤细胞系WM793，得到表达MT1‑MMP‑EGFP的稳定细胞株，即为所述的抗肿瘤药物筛选细胞模型。采用本发明专利技术提供的细胞模型筛选抗肿瘤药物，可以直接在荧光显微镜下观察MT1‑MMP‑EGFP的定位，筛选抑制MT1‑MMP‑EGFP的细胞膜定位的化学小分子，其简单，直观，操作方便。

An anti-tumor drug screening cell model and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其构建方法与应用
本专利技术涉及一种筛选药物的领域，特别涉及一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其构建方法与应用。
技术介绍
癌症是目前社会人们最关注的健康问题，目前在我国，癌症的发病率呈现爆发式增长，人们都是谈癌色变。而癌症转移是造成癌症病人死亡的主要原因。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类在细胞外基质降解过程中发挥重要作用的蛋白酶家族。基质金属蛋白酶大体可分为可溶型和膜型。其中膜I型基质金属蛋白酶又称作MT1-MMP或MMP-14,其可以定位在细胞膜上，通过降解细胞外基质，促进细胞侵袭、迁移等行为进而在多种人类疾病尤其是癌症的发生、生产、浸润、肿瘤血管生成中发挥重要作用。同时其对其它蛋白酶也具有活化的功能，对细胞外基质的降解起到间接促进的作用。又由于其暴露于细胞膜表面、易于与配体结合的特点，基质金属蛋白酶MT1-MMP是生理和病理环境下细胞侵袭的中枢调节因子，如免疫细胞的组织监视和癌细胞转移。MT1-MMP能切割大量的细胞内外蛋白质，包括细胞外基质蛋白、基质受体以及其他MMP，从而能够修饰细胞表面蛋白质组和细胞周环境。MT1-MMP对癌症转移是非常重要的，MT1-MMP定位于细胞膜上，可以通过内吞-胞吐作用循环利用。临床研究发现，MT1-MMP的表达与神经母细胞瘤，小细胞肺癌，头颈部癌，舌鳞状细胞癌，膀胱癌，卵巢癌等病人的不良预后密切相关。MT1-MMP的低表达在晚期结肠癌患者中被认为是良好的生存指标。抑制MT1-MMP的细胞膜定位，可以降低MT1-MMP对细胞外基质的降解，从而抑制肿瘤转移。因此，可以利用MT1-MMP的性质，设计出一种抗肿瘤药物的抗肿瘤药物的筛选细胞模型，用于筛选抗肿瘤药物。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术通过构建抗肿瘤药物的筛选细胞模型来筛选能够抑制MT1-MMP转运到细胞膜上的小分子化合物，以其作为治疗癌症转移的药物。在本专利技术的第一方面，提供了一种抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建方法，包括以下步骤：(1)先将EGFP基因融合到MT1-MMP的C端，并构建到病毒载体上，得到表达MT1-MMP-EGFP的病毒载体；(2)包装表达MT1-MMP-EGFP的病毒：将表达MT1-MMP-EGFP的病毒载体与病毒包装质粒gag-pol和VSV-G质粒共染到293T细胞中进行病毒包装，细胞基为新鲜的10％FBS的DMEM培养基，共转染12-24小时后，将共染的细胞换液，换成新的含10％FBS的DMEM培养基，24小时后，将上层培养基转移到干净的50ml离心管中，并重新给细胞加入新的DMEM培养基，连续收取三次。因病毒在细胞内包装并释放到培养基中，所收取的培养基中包含所需的病毒，将收取的含有病毒的细胞培养液离心，去除死细胞及其细胞残，得到含表达MT1-MMP-EGFP的病毒的上清液；(3)用含表达MT1-MMP-EGFP的病毒的上清液侵染黑色素瘤细胞系WM793，筛选得到表达MT1-MMP-EGFP的稳定细胞株，即为所述抗肿瘤药物的筛选细胞模型所述步骤(1)包括以下步骤：(a)设计含限制性内切酶BglII和AgeI酶切位点的引物对，对MT1-MMP基因全长序列进行PCR扩增，得到带有BglII和AgeI双酶切位点的MT1-MMP基因片段；所述引物对为：MT1-MMPNSBglII:5’-AATTAGATCTATGTCTCCCGCCCCAAGACC-3’；MT1-MMPCASAgeI:5’-AATTACCGGTGGGACCTTGTCCAGCAGGGAACG-3’。(b)使用限制性内切酶BglII和AgeI分别对pEGFP-N1质粒和步骤(a)得到的MT1-MMP基因片段进行酶切，得到pEGFP-N1质粒和MT1-MMP基因片段的双酶切产物，然后进行DNA连接，将MT1-MMP基因插入到pEGFP-N1质粒中，得到带有MT1-MMP基因的pEGFP-N1的阳性质粒pEGFP-N1-MT1-MMP；(c)使用限制性内切酶Bg1II和NotI分别对步骤(b)得到的阳性质粒pEGFP-N1-MT1-MMP和载体质粒pLPCX进行酶切，得到MT1-MMP-EGFP基因片段和载体质粒pLPCX的双酶切产物，所述载体质粒pLPCX为逆转录病毒载体，可以用于病毒的包装；将MT1-MMP-EGFP基因片段与载体质粒pLPCX的双酶切产物进行DNA连接反应，将MT1-MMP-EGFP基因插入到载体质粒pLPCX中，得到带有MT1-MMP-EGFP的pLPCX的病毒载体pLPCX-MT1-MMP-EGFP，即为表达MT1-MMP-EGFP的病毒载体。在本专利技术的第二方面，提供了上述构建方法构建出来的抗肿瘤药物的筛选细胞模型。在本专利技术的第三方面，提供了一种抗肿瘤药物筛选细胞模型的用途，用于筛选抗肿瘤药物。在本专利技术的第四方面，提供了一种抗肿瘤药物的筛选方法，所述方法包括：将待筛选的化学小分子处理表达MT1-MMP-EGFP的稳定细胞株，通过荧光显微镜观察，筛选出MT1-MMP-EGFP的稳定细胞株中能够使MT1-MMP从细胞膜转移到细胞质中的化学小分子，即为筛选出的抗肿瘤药物。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术通过选取合适的引物对，对MT1-MMP基因进行PCR扩增，可以准确地扩增出MT1-MMP基因。(2)本专利技术提供的抗肿瘤药物的筛选方法，通过选取BglII和AgeI酶，构建带有MT1-MMP基因的pPEGFP-N1质粒，然后在通过酶切反应得到带有BglII和NotI双酶切位点的MT1-MMP-EGFP基因，MT1-MMP-EGFP基因片段的纯度高，再与pLPCX质粒酶切产物进行DNA连接反应，得到表达MT1-MMP-EGFP的病毒载体，本专利技术通过选取合适的内切酶，酶切效率高，得到表达MT1-MMP-EGFP的病毒载体的滴度高。(3)采用本专利技术提供的抗肿瘤药物的筛选方法，可以直接在荧光显微镜下观察MT1-MMP-EGFP的定位，筛选抑制MT1-MMP-EGFP的细胞膜定位的化学小分子，即为抗肿瘤药物，其简单，直观，操作方便。附图说明图1为阳性质粒pEGFP-N1-MT1-MMP双酶切产物的电泳图；图2为病毒载体pLPCX-MT1-MMP-EGFP双酶切产物的电泳图；图3为表达绿色荧光蛋白的MT1-MMP-EGFP稳定细胞株的激光共聚焦显微镜图；图4为药物处理后的表达绿色荧光蛋白的MT1-MMP-EGFP稳定细胞株的激光共聚焦显微镜图；图5为表达绿色荧光蛋白的MT1-MMP-EGFP稳定细胞株的荧光显微镜图；图6为药物处理后的表达绿色荧光蛋白的MT1-MMP-EGFP稳定细胞株的荧光显微镜图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法们通常按照常规条件进行操作。除非另行定义，文中所述实用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。下述实施例所使用的MT1-MMP基因全长序列来自WM793细胞的cDNA；Bg1II购自NEB公司；AgeI购自NEB公司；NotI购自NEB公司；pEGFP-N1质粒购自addgene公司；pLPCX质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将EGFP基因融合到MT1‑MMP基因的C端，并构建到病毒载体上，得到表达MT1‑MMP‑EGFP的病毒载体；(2)将表达MT1‑MMP‑EGFP的病毒载体与病毒包装质粒一起共转染到受体细胞中进行病毒包装，收取含有病毒的细胞培养液离心，去除死细胞和细胞残渣后得到含表达MT1‑MMP‑EGFP的病毒的上清液；(3)用含表达MT1‑MMP‑EGFP的病毒的上清液侵染黑色素瘤细胞系WM793，筛选得到表达MT1‑MMP‑EGFP的稳定细胞株，即为所述的抗肿瘤药物筛选细胞模型。

【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将EGFP基因融合到MT1-MMP基因的C端，并构建到病毒载体上，得到表达MT1-MMP-EGFP的病毒载体；(2)将表达MT1-MMP-EGFP的病毒载体与病毒包装质粒一起共转染到受体细胞中进行病毒包装，收取含有病毒的细胞培养液离心，去除死细胞和细胞残渣后得到含表达MT1-MMP-EGFP的病毒的上清液；(3)用含表达MT1-MMP-EGFP的病毒的上清液侵染黑色素瘤细胞系WM793，筛选得到表达MT1-MMP-EGFP的稳定细胞株，即为所述的抗肿瘤药物筛选细胞模型。2.如权利要求1所述的抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)包括以下步骤：(a)设计含限制性内切酶BglII和AgeI酶切位点的引物对，对MT1-MMP基因全长序列进行PCR扩增，得到带有BglII和AgeI双酶切位点的MT1-MMP基因片段；(b)使用限制性内切酶BglII和AgeI分别对pEGFP-N1质粒和步骤(a)得到的MT1-MMP基因片段进行酶切，得到pEGFP-N1质粒和MT1-MMP基因片段的双酶切产物，然后进行DNA连接，将MT1-MMP基因插入到pEGFP-N1质粒中，得到带有MT1-MMP基因的pEGFP-N1的阳性质粒pEGFP-N1-MT1-MMP；(c)使用限制性内切酶Bg1II和NotI分别对步骤(b)得到的阳性质粒pEGFP-N1-MT1-MMP和载体质粒pLPCX进行酶切，得到MT1-MMP-EGFP...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙建伟，张旭，沈俊岭，张艺之，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：云南,53