本发明专利技术涉及一种包含水痘‑带状疱疹病毒(VZV)Oka株截短型糖蛋白E的重组表达。将携带水痘‑带状疱疹病毒v‑Oka株截短型糖蛋白E的基因片段的杆粒转染入昆虫SF9细胞(SF9细胞)中,得到的重组杆状病毒感染SF9细胞,表达得到可溶性的重组水痘‑带状疱疹病毒Oka株截短型糖蛋白E,该截短型gE保留了完整gE蛋白的抗原性。该表达方法易于筛选,简化后期纯化工作,能表达有困难的高价值蛋白,有助于目的蛋白的大规模生产,且批间质量稳定,可以为制备安全、有效的候选疫苗抗原预防带状疱疹的发生提供工艺基础。
【技术实现步骤摘要】
一种重组表达水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E的方法
本专利技术属于蛋白的重组表达方法,特别是涉及一种在真核细胞中重组表达水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E的方法。
技术介绍
水痘-带状疱疹病毒(Varicella-ZosterVirus,VZV)是一种具包膜的双链DNA病毒,属疱疹病毒科。原发感染引起水痘,再度被激活则引起带状疱疹(HerpesZoster,HZ),病毒可通过接触或飞沫传播,并在人体神经节内终生潜伏,外因刺激下可再次发作。水痘减毒活疫苗容易诱发成年人、老年人的HZ,尤其易引起老年人HZ复发,部分人会伴有严重并发症。随着年龄的增加,减毒疫苗对人的保护率逐渐下降。目前减毒活疫苗是研究较多的一类疫苗,但在理论上存在潜在致癌性,而亚单位疫苗去除了DNA成分,规避了上述风险,安全性更高。VZV包膜上有至少8种糖蛋白,其中糖蛋白E(gE)由ORF68基因编码,包含623个氨基酸残基,分子量最大、含量最高,是病毒主要抗原,也是制备亚单位疫苗的主要抗原。那么如何大规模生产出高价值的VZV糖蛋白E也是制备亚单位疫苗的关键之处。目前,有很多文献和专利报道了VZV糖蛋白E的改造及表达,如截短型gEaa1-511(Vafaietal.1993,1994,1995);截短型gEaa1-546(Haumontetal.1996,Jacquetetal.2002;GlaxoSmithKlineEP0405867B11990,WO0043527A12000);截短型gEaa1-539(CN1025173022011);包含gEaa37-161的融合蛋白的表达(CN1059067212016)等等。而体外基因真核细胞表达系统主要包括CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等,上述大多数VZV糖蛋白E的表达都使用了CHO体系。然而与其它真核表达系统相比较,杆状病毒表达系统最突出的特点是能获得重组蛋白高水平的表达,最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50%,这有利于目的蛋白的大规模生产,对于疫苗的制备很关键。本专利技术采用了杆状病毒表达系统表达了可溶性的VZV-Oka株截短型gE,该截短型gE保留了完整gE蛋白的抗原性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种重组表达水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E的方法。本专利技术提供的重组表达水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E的方法,是将携带水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E基因片段的杆粒转染入SF9昆虫细胞中,得到的重组杆状病毒感染SF9细胞,表达得到可溶性的重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E。具体方法为:水痘-带状疱疹病毒v-Oka株糖蛋白E基因进行密码子优化合成,选取gE的N端和C端部分氨基酸缺失的截短体作为表达区域,针对pFastBacTMHTA载体设计引物,选用EcoRⅠ和NotⅠ两个酶切位点,设计引物对相应区域基因序列进行PCR扩增,经过酶切,连接等系列操作,将目的基因克隆至pFastBacTMHTA供体质粒,生成重组载体质粒,将携带水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E的基因的质粒转化至DH10Bac感受态细胞中,经过系列蓝白斑筛选确认表型,提取杆粒,生成了重组杆粒。将携带水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E的基因的杆粒转染入SF9昆虫细胞中,生成重组杆状病毒,扩增杆状病毒库,使用该病毒库感染SF9昆虫细胞,表达得到可溶性的重组水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E。所述的pFastBacTMHTA供体质粒N端有6×His标签,可利用金属螯合树脂进行重组融合蛋白纯化,带有TEV蛋白酶酶切位点,可用于蛋白纯化后6×His标签的去除。所述的筛选条件为:制备含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素、100μg/mlBluo-gal和40μg/mlIPTG的LB琼脂板,用于筛选DH10BacTM转化体。具体方法为:将1ul重组质粒转化至100ulDH10BacTM感受态细胞中,加入900ulLB培养基振荡培养4h后,使用LB培养基进行10倍连续稀释细胞,将200ul各稀释度的细胞接种在上述制备的LB琼脂板上,37℃孵育48h,挑选白斑菌落,将其重新涂布于新制备的上述LB琼脂板中,37℃过夜孵育,接种白色单克隆至3ml含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素的LB培养基中,37℃振荡培养,至浑浊后,取出2ml加入上述LB培养基中,37℃,250rpm过夜孵育。用上述重组表达方法得到的水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E也属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供的重组表达水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E的方法,该方法是将去除部分信号肽、部分跨膜区和整个胞内区的水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E基因转化入DH10Bac感受态细胞中生成重组杆粒,重组杆粒转染SF9昆虫细胞后,生成的重组杆粒病毒感染SF9昆虫细胞表达可溶性的重组蛋白。该表达方法保留了水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E蛋白分子的抗原决定簇,同时去除其部分信号肽、部分跨膜区和整个胞内区,且选择的pFastBacTMHTA载体N端有6×His标签,可利用金属螯合树脂进行重组融合蛋白纯化,带有TEV蛋白酶酶切位点,可用于蛋白纯化后6×His标签的去除。该表达方法的优势在于:易于重组杆粒的筛选,简化后期纯化工作,能表达有困难的高价值蛋白,有助于目的蛋白的大规模生产,且批间质量稳定,可以为制备安全、有效的候选疫苗抗原预防带状疱疹的发生提供工艺基础。附图说明图1水痘-带状疱疹病毒v-Oka株全长gE和本专利技术水痘-带状疱疹病毒v-Oka株重组截短型gE的分子模式图图2pFastBacTMHTA载体结构示意图图3PCR扩增的截短型VZV-Oka株gpE基因的琼脂糖凝胶电泳结果图4重组表达载体质粒aagpE-pFastBacTMHTA的EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定结果图5重组表达杆粒的PCR鉴定结果图6用抗VZVgpE多抗进行重组杆粒初次感染SF9细胞后表达的重组截短型VZVgpE的westernblot的鉴定结果图7用抗VZVgpE多抗进行P1病毒储液感染SF9细胞后表达的重组截短型VZVgpE的westernblot的鉴定结果图8.用抗VZVgpE多抗和抗his标签的抗体进行P2病毒储液感染SF9细胞后不同时间点表达的重组截短型VZVgpE的westernblot的鉴定结果具体实施方式下面将结合具体实施例详细描述本专利技术。下面的实施例仅用于说明本专利技术,而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1.水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型gE(gpE)的重组表达本专利技术涉及水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型gE(gpE)的重组表达(简称截短型vOka-gpE)1.水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型gE(gpE)基因的获得(1)扩增截短型vOka-gpE基因的引物设计和合成图1示出水痘-带状疱疹病毒v-Oka株全长gE和本专利技术水痘-带本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组表达水痘‑带状疱疹病毒v‑Oka株截短型糖蛋白E的方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)构建携带水痘‑带状疱疹病毒v‑Oka株截短型糖蛋白E(gE)基因片段的重组杆粒;(2)将步骤(1)中构建的重组杆粒转染入SF9昆虫细胞中,生成重组杆状病毒;(3)扩增杆状病毒库,使用该病毒库感染SF9昆虫细胞,表达得到可溶性的重组水痘‑带状疱疹病毒v‑Oka株截短型糖蛋白E。
【技术特征摘要】
1.一种重组表达水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E的方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)构建携带水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E(gE)基因片段的重组杆粒;(2)将步骤(1)中构建的重组杆粒转染入SF9昆虫细胞中,生成重组杆状病毒;(3)扩增杆状病毒库,使用该病毒库感染SF9昆虫细胞,表达得到可溶性的重组水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤(1)中,将水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E的基因进行密码子优化合成,选取N端和C端部分氨基酸序列截短体的gE糖蛋白区段作为表达区域,针对pFastBacTMHTA载体选用EcoRⅠ和NotⅠ两个酶切位点,设计引物对相应区域基因序列进行PCR扩增,经过酶切、连接系列操作将目的基因克隆至pFastBacTMHTA供体质粒,生成重组载体质粒;将携带水...
【专利技术属性】
技术研发人员:魏滨,李小静,
申请(专利权)人:上海大学,
类型:发明
国别省市:上海,31
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