一种靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体及PDL1-CAR-T细胞制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒，包含以下编码序列：专门识别PDL1抗原的PD1蛋白的胞外域编码序列，人CD8铰链区编码序列、CD28跨膜区编码序列、人CD28胞内域编码序列和人CD3ζ编码序列；其编码序列为SEQ ID NO：1；本发明专利技术设计合成专门识别PD‑L1抗原的PD1胞外域，连带其他CAR共有的铰链区、共刺激区域等得到靶向PD‑L1的CAR嵌合受体的慢病毒，并将其感染T细胞，形成识别PD‑L1的CAR‑T细胞，而且PD‑1/PD‑L1结合后将会引起T细胞的激活和对肿瘤细胞的杀伤作用。

A Lentivirus Vector Targeting Car Chimeric Receptor of PDL1 and PDL1-CAR-T Cells

【技术实现步骤摘要】
一种靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体及PDL1-CAR-T细胞
本专利技术涉及肿瘤的免疫治疗
，具体说是一种靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体及PDL1-CAR-T细胞。
技术介绍
CAR-T又被称为嵌合抗原受体T细胞，通过基因工程将抗原识别区、铰链区以及共刺激分子区域等全部整合到T细胞基因组内，使T细胞特异性的识别肿瘤细胞并激活T细胞对肿瘤的杀伤。目前CAR-T细胞治疗也仅仅在血液肿瘤细胞疗效显著，但存在一定的局限性，首先能完美表达在肿瘤细胞而在正常细胞无表达的靶标抗原几乎不存在，所以目前的CAR-T细胞治疗会存在脱靶效应。同时肿瘤细胞是个复杂的群体，外面有复杂的肿瘤微环境，当有靶标抗原的肿瘤细胞被清除后，在肿瘤微环境各种因子刺激下会诱导新的肿瘤细胞的形成，导致肿瘤的复发甚至转移。随着对肿瘤免疫的深入研究发现肿瘤微环境可以保护肿瘤细胞不被机体的免疫系统识别和杀伤，肿瘤细胞的免疫逃逸在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用。有正性和负性信号调控机体免疫细胞的激活与抑制，其中程序性死亡分子(programmeddeath1,PD-1)/PD-1配体(PD-1ligand,PD-L1)是负性免疫调节信号，抑制肿瘤特异性CD8+T细胞的免疫活性，介导免疫逃逸。越来越多的研究证实PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤免疫中起到关键作用，也为肿瘤免疫治疗提供新的分子靶点，阻断PD-1/PD-L1信号通路的激活可以增强抗肿瘤免疫治疗效应，并且PD-L1在大多数癌症组织中过量表达，包括NSCLC、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、消化道肿瘤、肺癌等。IFN-γ为γ干扰素，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调控的作用，研究发现在多发性骨髓瘤中，肿瘤微环境中IFN-γ可以促进骨髓瘤细胞表面PD-L1蛋白的表达，激活T细胞PD-1/PD-1信号通路从而抑制T细胞的激活、增殖，诱导特异性的CTL的凋亡，使CTL细胞毒杀伤作用下降，使肿瘤细胞发生免疫逃逸。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体及PDL1-CAR-T细胞。本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：一种靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒，包含以下编码序列：专门识别PDL1抗原的PD1蛋白的胞外域编码序列，人CD8铰链区编码序列、CD28跨膜区编码序列、人CD28胞内域编码序列和人CD3ζ编码序列；其编码序列为SEQIDNO：1。一种PDL1-CAR-T细胞，包含权利要求1所述靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒基因。本专利技术还包括一种靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒的制备方法，包括以下步骤：①设计合成以下多核苷酸序列：专门识别PDL1抗原的PD1蛋白的胞外域编码序列，人CD8铰链区编码序列、CD28跨膜区编码序列、人CD28胞内域编码序列和人CD3ζ编码序列，并在多核苷酸序列的两端分别添加XbaI与BamHI，并将其连接在Blunt质粒载体中，得到Blunt-PD1质粒；②用XbaI与BamHI酶酶切PLVX载体质粒与Blunt-PD1载体质粒，露出各自的粘性末端后，再用T4连接酶，将它们连接在一起，并转化至stbl3菌株中，挑取单克隆提质粒并用XbaI与BamHI双酶切，筛选质粒并测序验证，得到靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒。本专利技术还包括PDL1-CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：⑴对靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒进行质粒大提，然后与293ft细胞进行质粒包装，转染，收集病毒上清液，得到PDL1-CAR病毒上清；⑵分离人全血中的淋巴细胞，磁珠分选分离出T细胞，培养后加入PDL1-CAR病毒上清，培养，转染，得到PDL1-CAR-T细胞。本专利技术还包括PDL1-CAR-T细胞的应用，在杀伤多发性骨髓瘤细胞方面的应用。优选的PDL1-CAR-T细胞的应用，在应用过程中加入IFN-γ。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术设计合成专门识别PD-L1抗原的PD1胞外域，连带其他CAR共有的铰链区、共刺激区域等得到靶向PD-L1的CAR嵌合受体的慢病毒，并将其感染T细胞，形成识别PD-L1的CAR-T细胞(PDL1-CAR-T细胞)，而且PD-1/PD-L1结合后将会引起T细胞的激活和对肿瘤细胞的杀伤作用，而非抑制作用；并且体内外IFN-γ与PDL1-CAR-T细胞联用能明显进一步增强PDL1-CAR-T细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用。附图说明图1为靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒的多核苷酸序列连接示意图；图2为病毒包装时PDL1-CAR不同剂量下观测到的荧光示意图；图3为四种多发性骨髓瘤细胞系在IFN-γ刺激24小时后，各组PDL1蛋白表达阳性的细胞占总细胞的百分比率示意图；图4为空白T细胞与PDL1-CAR-T细胞分别与U266按照不同效靶比混合孵育24小时后，对U266的杀伤作用示意图；图5为给药十五天后小鼠发光成像系统观察肿瘤细胞的增殖变化示意图。具体实施方式本专利技术的目的是提供一种靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体及PDL1-CAR-T细胞，通过以下技术方案实现：一种靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒，包含以下编码序列：专门识别PDL1抗原的PD1蛋白的胞外域编码序列，人CD8铰链区编码序列、CD28跨膜区编码序列、人CD28胞内域编码序列和人CD3ζ编码序列；其编码序列为SEQIDNO：1。一种PDL1-CAR-T细胞，包含权利要求1所述靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒基因。本专利技术还包括一种靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒的制备方法，包括以下步骤：①设计合成以下多核苷酸序列：专门识别PDL1抗原的PD1蛋白的胞外域编码序列，人CD8铰链区编码序列、CD28跨膜区编码序列、人CD28胞内域编码序列和人CD3ζ编码序列，并在多核苷酸序列的两端分别添加XbaI与BamHI，并将其连接在Blunt质粒载体中，得到Blunt-PD1质粒；②用XbaI与BamHI酶酶切PLVX载体质粒与Blunt-PD1载体质粒，露出各自的粘性末端后，再用T4连接酶，将它们连接在一起，并转化至stbl3菌株中，挑取单克隆提质粒并用XbaI与BamHI双酶切，筛选质粒并测序验证，得到靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒。本专利技术还包括PDL1-CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：⑴对靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒进行质粒大提，然后与293ft细胞进行质粒包装，转染，收集病毒上清液，得到PDL1-CAR病毒上清；⑵分离人全血中的淋巴细胞，磁珠分选分离出T细胞，培养后加入PDL1-CAR病毒上清，培养，转染，得到PDL1-CAR-T细胞。本专利技术还包括PDL1-CAR-T细胞的应用，在杀伤多发性骨髓瘤细胞方面的应用。优选的PDL1-CAR-T细胞的应用，在应用过程中加入IFN-γ。其中IFN-γ的添加量为IFN-γ：PDL1-CAR-T细胞个数＝(1000IU/毫升：5*106～10*106细胞数)本专利技术实施例中XbaI与BamHI酶购自于Thermofisher公司，PLVX载体质粒购自于上海信裕生物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒，其特征在于：包含以下编码序列：专门识别PDL1抗原的PD1蛋白的胞外域编码序列，人CD8铰链区编码序列、CD28跨膜区编码序列、人CD28胞内域编码序列和人CD3ζ编码序列；其编码序列为SEQ ID NO：1。

【技术特征摘要】
1.一种靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒，其特征在于：包含以下编码序列：专门识别PDL1抗原的PD1蛋白的胞外域编码序列，人CD8铰链区编码序列、CD28跨膜区编码序列、人CD28胞内域编码序列和人CD3ζ编码序列；其编码序列为SEQIDNO：1。2.一种PDL1-CAR-T细胞，其特征在于：包含权利要求1所述靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒基因。3.权利要求1所述一种靶向PDL1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：①设计合成以下多核苷酸序列：专门识别PDL1抗原的PD1蛋白的胞外域编码序列，人CD8铰链区编码序列、CD28跨膜区编码序列、人CD28胞内域编码序列和人CD3ζ编码序列，并在多核苷酸序列的两端分别添加XbaI与BamHI，并将其连接在Blunt质粒载体中，得到Blunt-PD1质粒；②用XbaI与BamHI酶酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘江，张文，唐东起，
申请(专利权)人：山东大学第二医院，
类型：发明
国别省市：山东,37