一种简易分离烟草青枯病菌的方法技术

本发明专利技术公开一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征包括以下步骤：1病样采集；2病原菌分离；3病原菌培养；4菌悬液制备；5PCR扩增与鉴定。本发明专利技术采集田间病叶，切取叶柄处的叶脉维管束，利用叶脉维管束中青枯菌的含量远高于其他微生物这一特点，分离纯化烟草青枯病菌，本发明专利技术目标选择性强，纯化速度快，效率高，分离纯化率在84％以上，而且可确保为该病病原菌。采用本发明专利技术，可快捷准确地获得目标病原，为后续研究奠定基础。一般的科技人员也十分容易掌握本方法。

A simple method for isolation of tobacco bacterial wilt

【技术实现步骤摘要】
一种简易分离烟草青枯病菌的方法
本专利技术属于植物病害
，具体涉及一种简易分离烟草青枯病菌的方法。
技术介绍
烟草青枯病(Tobaccobacterialwilt)是热带、亚热带地区烟草的主要病害之一。1880年，烟草青枯病首先发现于美国北卡罗来纳州格兰维尔(Granville)，也称作“Granvillewilt”，而后在印度尼西亚、日本、澳大利亚和韩国等国逐渐演变为烟草上的重要病害。该病害在我国长江流域及其以南各烟区普遍发生，其中广西、广东、福建、湖南、浙江、安徽、四川及贵州等省危害严重。云南省早在1987年就有烟草青枯病的报道，但危害较轻。2002年以来，云南省南部旱地烟区青枯病危害逐渐加重，局部地块发病率达到80％以上。目前，该病在云南省的文山、保山、临沧、红河、昆明、玉溪、曲靖、昭通、大理、丽江、楚雄和德宏等州市均有发生，其中文山、临沧、保山和德宏的部分地区发病较为严重。虽然烟草青枯病在云南省发病较为严重，但对该病的研究相对不足，尤其在病原学方面的研究尚少。分离纯化该病病原菌获得纯培养物是开展相关研究的基础。烟草青枯病为青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)侵染引起的细菌性土传病害。病原菌菌体杆状，两端钝圆，大小0.9-2μm×0.5-0.8μm，有1-3根鞭毛，多单极生，无荚膜。病菌生长温限10℃-37℃，30-35℃最适。现有的分离方法为组织分离法，用灭菌后的刀削去植株茎杆病健交界处的表皮，取病健交界处的维管束组织，置于无菌水中浸泡后划线稀释菌液的方法纯化病原菌。由于烟草青枯病经常与黑胫病等根茎病害混合发生，加之显症茎杆中含有大量其他腐生菌。因此，该方法常会分离到多种其他的微生物，而得不到该病病原菌，分离纯化效率低。一般的科技人员采用组织分离法，常会导致分离不到烟草青枯病，将目标病原搞错。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种简易分离烟草青枯病菌的方法，该方法能快速而准确地获得该病病原菌，有效排除其他病菌，提高分离纯化效率。一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征在于包括以下步骤：1、病样采集从田间采集发病的叶片，观察叶脉维管束是否有黑色斑点，若有则视为青枯病发病株；将整片叶片放入采样袋，带回实验室。2、病原菌分离去除叶柄以外的组织，用酒精表面消毒，用无菌刀片切除叶脉维管束以外的上表皮、栅栏组织、海绵组织和下表皮，切取叶柄基部的叶脉维管束；将叶脉维管束用无菌刀片切成若干块的组织块；置于含有无菌水的灭菌培养皿中浸泡5-10min，待组织块周围有乳白色菌液溢出后，用无菌枪头混匀菌液。3、病原菌培养用移液器吸取菌液滴加到TTC平板的一侧，用无菌牙签划线，超净工作台吹干后置于28-30℃培养箱中暗培养24-48h。22-25h后形成透明的小菌落，36-48h后形成不规则形或近圆形菌落，具有较宽的白边，流动性较强，中间呈粉红色或浅红色稀液状。4、菌悬液制备5、PCR扩增与鉴定烟草青枯菌的PCR鉴定采用通用引物Rs-759(5'-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3')和Rs-760(5'-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3')扩增特异片段，扩增结束后分别取PCR产物各3-7μL，加载于2％的琼脂糖凝胶的胶孔中，以适当DNA标样为对照，在120V恒压下分离30-45min，取出凝胶浸泡于含有5μg/mL的EB核酸染液中10min；置于凝胶成像仪上获取PCR产物分离情况，若为烟草青枯菌则在200和300bp之间接近300bp处有一条大小为281bp的条带。进一步，步骤1采集的病叶，表现形状为叶片一边部分叶肉组织呈水泽状、萎蔫、变黄、膏药状枯斑或病叶一边发育不正常而弯曲变形。进一步，步骤2中，用酒精表面消毒时，使用70％酒精进行表面消毒，时间为3-7min；切取叶柄基部的叶脉维管束时，切取的长度为3-5cm；所述组织块大小为3-5mm×3-5mm；所述灭菌培养皿中的无菌水为8-12mL；所述无菌枪头为10mL无菌枪头。进一步，步骤3中，吸取的菌液含量为15-30μL；所述TTC平板的制作方法为：分别称取蛋白胨10.0g、葡萄糖10.0g、酪素水解物1.0g和琼脂15.0g，加蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌20min后置于55℃水浴锅，待培养基温度降至55℃时加入终浓度为0.005％的氯化三苯基四氮唑(TTC)，混匀后在每个无菌培养皿中加入23-28mL培养基，冷凝后制成的平板为含TTC的平板。进一步，步骤4中，菌悬液的制备方法为用10μL无菌枪头挑取菌体于含有10μL无菌水的PCR管中，涡旋震荡后取1μL用于菌落PCR鉴定分离物。进一步，步骤5中，PCR反应体系为25μL，反应体系由12.5μL2×EsTaqMasterMix(Dye)、10.5μLddH2O、0.5μL10μMRs-759、0.5μL10MRs-760和1μL菌悬液组成；PCR反应条件为94℃预变性2min，扩增循环包括94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，扩增30个循环，最后72℃延伸2min，并将PCR产物保存于4℃或直接用于琼脂糖凝胶电泳。本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：样品采集易行，分离速度快，简便快捷，分离纯化效率高。目前烟草青枯病在采集病样时，通常从植物的茎秆处采集，样品采集过程繁琐、需求量大，本方法仅需采集发病烟叶，大大简化取样的操作步骤，减少每份样品的需求量。目前，烟草青枯病菌的分离时，常从带病茎杆病健交界处分离，由于通常选取的病组织为发病后期的典型病样，病样中腐生大量其他微生物，样品分离时常分离到其他细菌而导致目标病原菌弄混弄错。而本专利技术从发病植株上选取带病叶片，从叶柄基部处摘下叶片，切取叶柄内的叶脉维管束。叶柄维管束组织为青枯菌向植株地上部分扩散的尖端，菌种相对单一，目标菌株选择性强，纯化速度快，效率高，分离纯化率84％以上，而且可确保为该病病原菌。采用本专利技术，可快捷准确地获得目标病原，为后续研究奠定基础。一般的科技人员也十分容易掌握本方法。附图说明图1为云南省德宏州烟草青枯病疑似病原物的PCR检测；图2为云南省普洱市烟草青枯病疑似病原物的PCR检测；图3为云南省临沧市烟草青枯病疑似病原物的PCR检测；图4为云南省文山州烟草青枯病疑似病原物的PCR检测；其中，A为青枯菌特异性条带。具体实施方式实施例1一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征在于包括以下步骤：1、从云南省德宏州青枯病发病田的烟株上选取叶片一边部分叶肉组织呈水泽状、萎蔫、变黄、膏药状枯斑或病叶一边发育不正常而弯曲变形的病叶；从叶柄处摘下叶片，观察叶脉维管束是否有黑色斑点，若有则视为青枯病发病株；将整片叶片放入采样袋，带回实验室，共采集10份病样。2、病原菌分离去除叶柄以外的组织，70％酒精表面消毒5min；用无菌刀片切取叶脉维管束以外的上表皮、栅栏组织、海绵组织和下表皮，并切取叶柄基部4.0cm的叶脉维管束；将叶脉维管束用无菌刀片切成若干块大小为5mm×5mm的组织块；置于含有10mL无菌水的灭菌培养皿中浸泡5min；待组织块周围有乳白色菌液溢出后，用10mL无菌枪头混匀菌液。3、病原菌培养用移液器吸取20μL菌液于含有TTC的平板中，用无菌牙本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征包括以下步骤：(1)病样采集从田间发病烟株采集病叶，观察叶脉维管束是否有黑色斑点，若有则视为青枯病发病株；将整片烟叶放入采样袋，带回实验室；(2)病原菌分离去除叶柄以外的组织，用酒精表面消毒，用无菌刀片切除叶脉维管束以外的上表皮、栅栏组织、海绵组织和下表皮，切取叶柄基部的叶脉维管束；将叶脉维管束用无菌刀片切成若干组织块；置于含有无菌水的灭菌培养皿中浸泡5‑10min，待组织块周围有乳白色菌液溢出后，用无菌枪头混匀菌液；(3)病原菌培养用移液器吸取菌液于含有TTC的平板中，用无菌牙签划线稀释菌液，置于超净工作台吹干；置于28‑30℃培养箱中暗培养24‑48h，于22‑25h后形成透明的小菌落，36‑48h后菌落呈不规则形或近圆形，具有较宽的白边，流动性较强，中间呈粉红色或浅红色稀液状；(4)菌悬液制备(5)PCR扩增与鉴定烟草青枯菌的PCR鉴定采用青枯菌检测的通用引物Rs‑759(5'‑GTCGCCGTCAACTCACTTTCC‑3')和Rs‑760(5'‑GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG‑3')扩增特异片段，扩增结束后取PCR产物各3‑7μL，加载于2％的琼脂糖凝胶的胶孔中，以适当的DNA标样为对照，在120V恒压下分离30‑45min，将凝胶浸泡于含5μg/mL EB的核酸染液10min；置于凝胶成像仪上获取PCR产物分离情况，若为烟草青枯菌则在200和300bp之间接近300bp处有扩增产物条带。...

【技术特征摘要】
1.一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征包括以下步骤：(1)病样采集从田间发病烟株采集病叶，观察叶脉维管束是否有黑色斑点，若有则视为青枯病发病株；将整片烟叶放入采样袋，带回实验室；(2)病原菌分离去除叶柄以外的组织，用酒精表面消毒，用无菌刀片切除叶脉维管束以外的上表皮、栅栏组织、海绵组织和下表皮，切取叶柄基部的叶脉维管束；将叶脉维管束用无菌刀片切成若干组织块；置于含有无菌水的灭菌培养皿中浸泡5-10min，待组织块周围有乳白色菌液溢出后，用无菌枪头混匀菌液；(3)病原菌培养用移液器吸取菌液于含有TTC的平板中，用无菌牙签划线稀释菌液，置于超净工作台吹干；置于28-30℃培养箱中暗培养24-48h，于22-25h后形成透明的小菌落，36-48h后菌落呈不规则形或近圆形，具有较宽的白边，流动性较强，中间呈粉红色或浅红色稀液状；(4)菌悬液制备(5)PCR扩增与鉴定烟草青枯菌的PCR鉴定采用青枯菌检测的通用引物Rs-759(5'-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3')和Rs-760(5'-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3')扩增特异片段，扩增结束后取PCR产物各3-7μL，加载于2％的琼脂糖凝胶的胶孔中，以适当的DNA标样为对照，在120V恒压下分离30-45min，将凝胶浸泡于含5μg/mLEB的核酸染液10min；置于凝胶成像仪上获取PCR产物分离情况，若为烟草青枯菌则在200和300bp之间接近300bp处有扩增产物条带。2.根据权利要求1所述的一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征在于：步骤1采集的叶片，典型病状为叶片一边部分叶肉组织呈水泽状、萎蔫、变黄、膏药状枯斑或病叶一边发育不正常而弯曲变形。3.根据权利要求1所述的一种简易分离烟草青枯病菌的...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢灿华，刘俊莹，夏振远，马俊红，盖晓彤，莫笑晗，余清，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53