一种菌剂及其培养方法、应用技术

本发明专利技术涉及微生物领域，本发明专利技术提供了一种菌剂，主要包括以下菌株中的一种或两种：a)甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)T1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18029；保藏时间为：2019年6月26日；b)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18030；保藏时间为：2019年6月26日。本发明专利技术的菌剂在抑菌方面具有优异的效果，尤其在抗桃褐腐病、抗桃流胶病、生菜培育方面均具有很广泛的应用。

A fungicide and its culture method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种菌剂及其培养方法、应用
本专利技术涉及微生物领域，具体而言，涉及一种菌剂及其培养方法、应用。
技术介绍
桃原产于中国，至今3000多年的历史，是世界性大宗水果，中国是桃栽培历史最久的国家，也是世界桃生产第一大国。据统计我国保存有1500余份桃资源，包含光核桃、山桃、普通桃、新疆桃、陕甘山桃和甘肃桃6个种。近十年来随着生产技术的提升，桃产业也在迅速发展，种植面积逐年递增，大桃产量随之升高，但中国桃产业依然存在一些问题，如中、短需冷量的桃品种不足，流胶病、褐腐病等病害发生严重，储运保鲜能力弱等问题，依然是制约大桃经济发展的重要因素，研究工作者越来越注重桃果实的品质、储存条件以及病害预防的研究。桃园中发现的主要病害有桃褐腐病、细菌性穿孔病、桃流胶病和桃疮痂等，目前抑制病害主要采用物理防治的方法，比如在春季花期前及时清除树上、树下的病果、病叶和病枝等，集中烧毁，减少初侵染源，在生长季节及时剪除病叶、病枝和病果等，带出园地销毁，减少再侵染源，或采用除病块，树干涂抹，喷施保护剂等方法进行防治。常用的化学药剂有石硫合剂、多菌灵和丙环唑等杀菌剂。但是上述防治措施均存在防治成本高、耗时长、污染环境等问题，而且防治抑菌效果不佳，对于潜伏于树皮下的病害不易清除，不能达到较好的控制病害的效果。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种菌剂，该菌剂为两种菌株复合或单一使用的微生物菌剂，比传统防治措施成本低、效率高、绿色环保，同时增加了植物体内的营养物质的含量，增加了植物的抗性和适应环境的能力。本专利技术的第二目的在于提供上述菌剂的培养方法，该培养方法简单、易于操作、操作条件温和。本专利技术的第三目的在于提供上述菌剂的进一步应用，应用广泛，可以广泛的应用在植物的抗病以及促生等方面，尤其对于桃树抑制病害的效果较好。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术提供了一种菌剂，主要包括以下菌株中的一种或两种：a)甲基营养芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)T1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.18029；保藏时间为：2019年6月26日；b)枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)T2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.18030；保藏时间为：2019年6月26日。其中，甲基营养芽孢杆菌(以下简称菌株A)为土壤中分离出的菌株，其菌落形态描述特征为：白色，不透明，表面中央部分褶皱，周围光滑。枯草芽孢杆菌(以下简称菌株B)为从桃树根部组织分离出的内生菌，菌落形态描述特征为：菌落呈奶白色、不透明、表面隆起且褶皱干燥。本专利技术的上述两种菌株均保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏地址均为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。采用上述菌剂时，在一些具体实施方式中，所述菌剂中，甲基营养芽孢杆菌(菌株A)与所述枯草芽孢杆菌(菌株B)的活菌数比为(0.5-2):1，优选为1:1。该菌剂的类型可以为固体或液体，当两个菌株复合使用时，菌株A与菌株B的活菌数比可以为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1等，两种菌株主要起抑菌作用的为菌株A，当两者的活菌数比1:1的条件下其抑菌效果最为优异。采用上述菌剂时，在一些具体实施方式中，主要由甲基营养芽孢杆菌液和枯草芽孢杆菌液组成，甲基营养芽孢杆菌液和枯草芽孢杆菌液的OD600均在0.6-0.8之间，且所述甲基营养芽孢杆菌液与所述枯草芽孢杆菌液的体积比为(0.5-2):1，优选为1:1；优选地，所述甲基营养芽孢杆菌液和枯草芽孢杆菌液的OD600均为0.6，因为当两种菌株OD600在这个数值时，其菌落呈对数增长，活菌数基本相同。所以实际操作时，最优的操作方式为：先将两种菌株在基础培养基中培养后形成种子液，再在OD600都达到0.6时，将种子液各取相同的体积接种于发酵培养基上进行复合培养。在实际操作中，可通过比浊法确定两种菌液浓度为1:1进行混合培养，然后取出一定体积的复合菌剂梯度稀释在平板上进行涂布，经约12h，在平板上数单菌落，确定活菌数基本相同。采用上述菌剂时，在一些具体实施方式中，所述菌剂无论是液体菌剂或固体菌剂，其总活菌数为1×107CFU/mL以上，比如为1×108CFU/mL、2×108CFU/mL、3×108CFU/mL、4×108CFU/mL、5×108CFU/mL、6×108CFU/mL、7×108CFU/mL、8×108CFU/mL、9×108CFU/mL、1×109CFU/mL、2×109CFU/mL、3×109CFU/mL、4×109CFU/mL、5×109CFU/mL、6×109CFU/mL、7×109CFU/mL、8×109CFU/mL、9×109CFU/mL、1×1010CFU/mL等等。最优地，所述菌剂的总活菌数为1×109CFU/mL以上，后续试验证明在该总活菌数下其抑菌效果最为优异。本专利技术还提供了上述菌剂的培养方法，包括如下步骤：将由所述甲基营养芽孢杆菌与所述枯草芽孢杆菌组成的种子液接种于发酵培养基中，25℃-35℃培养40h以上，优选地30℃培养42h；优选地，所述发酵培养基的组成为：硫酸镁0.3-1g/L，磷酸二氢钾0.5-2g/L，酵母浸粉14-16g/L，维生素B18-12mg/L，葡萄糖18-22g/L；优选地，所述发酵培养基的组成为：硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，酵母浸粉15g/L，维生素B110mg/L，葡萄糖20g/L。优选地，所述发酵培养基的pH为5-7之间，优选为pH5.5，pH还可以为6、6.5等等。优选地，所述种子液的接种量为1-9v/v％之间，优选地为3v/v％，接种量还可以为5％、7％等等。通过对复合后菌株发酵的各个操作条件进行优化后，使得菌株能够保证良好的生长，并提高活性物质的产量。本专利技术还提供了上述菌剂在抑制桃树病害以及促桃树生长方面的应用以及在生菜培育方面的应用，比如对于生菜的促生以及抑菌效果方面，对于其他植物也同样具有良好的抑菌、促生效果，当然重要的还是体现在抑菌方面。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术的菌剂比传统防治措施成本低、效率高、绿色环保，同时增加了植物体内的营养物质的含量，增加了植物的抗性和适应环境的能力；(2)本专利技术的菌剂的发酵方法简单、易于操作、操作条件温和；(3)本专利技术的菌剂在植物的抗病以及促成方面具有很广泛的应用，尤其在桃树的抑制病害方面应用较优异。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实验例3中不同浓度葡萄糖构成的复合菌剂发酵液对桃褐腐病的抑菌效果的试验结果图；图2为本专利技术实验例3中不同浓度条件下的酵母浸粉复合菌剂发酵液对桃褐腐病的抑菌效果的试验结果图；图3为本专利技术实验例3中不同接种量条件下的复合菌剂发酵液对桃褐腐病的抑菌效果的试验结果图；图4为本专利技术实验例3中不同容量条件下的复合菌剂发酵液对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种菌剂，其特征在于，主要包括以下菌株中的一种或两种：a)甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)T1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18029；保藏时间为：2019年6月26日；b)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18030；保藏时间为：2019年6月26日。

【技术特征摘要】
1.一种菌剂，其特征在于，主要包括以下菌株中的一种或两种：a)甲基营养芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)T1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.18029；保藏时间为：2019年6月26日；b)枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)T2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.18030；保藏时间为：2019年6月26日。2.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中，所述甲基营养芽孢杆菌与所述枯草芽孢杆菌的活菌数比为(0.5-2):1，优选为1:1。3.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于，主要由甲基营养芽孢杆菌液和枯草芽孢杆菌液组成，甲基营养芽孢杆菌液和枯草芽孢杆菌液的OD600均在0.6-0.8之间，且所述甲基营养芽孢杆菌液与所述枯草芽孢杆菌液的体积比为(0.5-2):1，优选为1:1；优选地，所述甲基营养芽孢杆菌液和枯草芽孢杆菌液的OD600均为0.6。4.根据权利要求1-3任一项所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液体菌剂，总活菌数为1×107CFU/mL以上，优选1×109CFU/mL以上。5.根据权利要求1或2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘悦萍，常昊天，王芳，侯旭，袁雪，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京,11