麦角硫因的纳米生物学制备方法技术

麦角硫因的纳米生物学制备方法。利用纳米基因编辑技术，即纳米粒子负载Cas9蛋白合成质粒和向导RNA合成质粒，成功改造谷胱甘肽缺陷型大肠杆菌细胞或酵母菌细胞，并利用纳米输送技术将串联表达EgtA，B，C，D，E蛋白的质粒运送至谷胱甘肽缺陷型细胞体内，实现麦角硫因生物制造的高产。

Preparation of ergothione by nano-biological method

【技术实现步骤摘要】
麦角硫因的纳米生物学制备方法
本专利技术涉及一种麦角硫因的制备工艺。具体地说，涉及一种麦角硫因的生物学制备方法。
技术介绍
麦角硫因是一种含有硫醇基团的组氨酸衍生物，于1909年首次被法国科学家CharlesTanret从黑麦麦角菌(Clavicepspurpurea)中分离出来。这种天然稀有的氨基酸，在自然界中主要由真菌和细菌合成，通过食物链进入动物和人类体内。目前尚未发现动物或人体内能自身合成此类氨基酸。麦角硫因的水溶性好，但不能通过自由扩散进入动物细胞，只能选择性地通过表达有OCT1(有机阳离子转运蛋白)的细胞膜运输至细胞内。大量体内和体外实验已证明，麦角硫因具有其他生物分子不可匹敌的抗氧化功能，可作为细胞保护剂，抵抗细胞体内生成的活性氧自由基，起到抗癌变、抗衰老的作用。与已经广泛使用的生物抗氧化剂谷胱甘肽相比，麦角硫因的化学性更加稳定，抗氧化能力更加显著，具有非常广阔的生物医药应用前景。目前工业生产麦角硫因主要通过化学合成、天然产物提取和生物发酵来实现。化学合成方法得到的麦角硫因产率和纯度低，杂质难以去除，具有一定的生物毒性。天然产物提取的方法主要是通过对真菌成品进行化学萃取的方式来获取，成本高，产率低，且化学萃取剂残留较多。生物发酵生产麦角硫因是近年来比较推崇的工业化推广方式，目前比较成熟的技术集中于，如中国专利技术专利CN103734022A，欧盟专利EP3150711A1，通过对蘑菇等真菌菌丝体进行液体深层发酵的方法得到麦角硫因，麦角硫因的发酵产量最高可达到143.7或315.7毫克/升发酵液，再经过热水或酒精或二者混合物提纯。但此种技术的主要缺点在于蘑菇菌丝体发酵生产周期较长(典型的为3-4周)，生产出的麦角硫因大量集聚在菌丝体内而不在发酵液内，进一步提纯产品的工序比较复杂，不利于大规模生产。随着麦角硫因的生物合成途径被揭示(J.Am.Chem.Soc.，2010，132，6632-6633；Angew.Chem.Int.Ed.，2017，56，12508-12511)，通过基因重组技术将麦角硫因合成通路中的关键酶转入大肠杆菌等微生物体内，经过代谢或发酵工程生产麦角硫因的技术被相应提出(中国专利CN104854245A，CN106661585A)。通过该基因重组技术生产的麦角硫因，发酵产量可在24小时内达到10-30毫克/升发酵液。2018年2月美国化学会《农业与食品化学》杂志正式刊登了日本北海道大学工程学院应用生物化学系大利微(TohruDairi)教授科研组的最新科研成果(J.Agric.Food.Chem.，2018，66，1191-1196)。该科研组研究人员将麦角硫因生物合成途径中关键的四个合成酶EgtB，EgtC，EgtD及EgtE的核算序列(没有克隆EgtA酶，而是利用了大肠杆菌内在的具有与EgtA同源基因的gshA酶)，使用同一个质粒上负载并在大肠杆菌中表达，并调整各种反应底物的浓度和种类，首次实现麦角硫因的微生物发酵工程生产实践，发酵产量可在72小时内达到24毫克/升发酵液。然而以上研究进展仍未解决一些关键技术性问题，限制了麦角硫因的生物制造达到高产的目的。这些问题主要有两方面：(1)导入微生物体内的EgtB酶活性偏低，造成中间产物组氨酸甜菜碱的大量积聚，不能及时转化为产物；(2)微生物体内谷胱甘肽的自身合成途径与导入的麦角硫因生物生产有竞争机制，限制了后者的产量。我们这里提出使用“nano-CRISPR/Cas9”(即纳米基因编辑)技术，在不同的真核和原核微生物体内进行相应的基因编辑，解决以上诸多限制麦角硫因生物合成达到高产的瓶颈问题。CRISPR英文全称ClusteredRegularlyInterspersedShortPalindromicRepeats(规律成簇间隔的短回文重复序列)。CRISPRassociated(与CRISPR相关联的)，又简称Cas。典型的CRISPR/Cas9基因编辑系统基本上有两个功能组件组成：Cas9核酸酶和向导RNA(guideRNA或者gRNA)。Cas9核酸酶在结合向导RNA后，由向导RNA引领Cas9蛋白与向导RNA所识别的基因组DNA序列相结合。然后，Cas9蛋白行使核酸酶的功能切割DNA，造成DNA的双链断裂。借助细胞内源性的DNA损伤修复机制，断裂的DNA双链可以被100％修复恢复原状(在有外源修复模板DNA的情况下可用此机制实现基因敲入)；或者在NHEJ修复机制下，产生序列插入和删除，并由此导致靶基因表达的修改。2013年由美国和德国科学家首次将此项技术应用于哺乳动物细胞，以实现基因编辑功能，目前已成为生物技术研发中最为热门的前沿领域之一。相比以往所有的基因编辑体系，CRISPR/Cas9技术通过模拟自然界中因噬菌体入侵而引发的、由细菌体内产生的获得性免疫反应机制，来实现高效率、低错误的基因改造。然而，现有的CRISPR-Cas9系统也有一些自身的不足。这其中包括任何现有的基因编辑技术都面临的一些系统性难题，尤其以脱靶效应和活体运送效率低下为难中之难。脱靶效应是指CRISPR-Cas9系统对基因序列的识别主要是通过一段20个碱基对大小的向导RNA来实现的，在很多情况下，Cas9蛋白在数个碱基对错配的情况下仍然能够切割，增加了基因编辑的非特异性和失准性。另外一方面，CRISPR/Cas9基因编辑系统目前主要采用病毒载体(比如，腺病毒)进行投递，一般将Cas9蛋白和gRNA的表达质粒用病毒作为载体，进行体内和体外感染投递。因Cas9蛋白或其表达质粒的分子量较大，而病毒载体的容量有限，这一投递方式效率比较低下，且全部依赖病毒的种类及其感染效率，在很多生物体系中不可实现。这里，在我们设计的Nano-CRISPR生物导入体系中，我们把Cas9表达质粒和向导RNA质粒吸附在以二氧化硅为基础的复合纳米颗粒为载体，形成一个CRISPR复合功能纳米颗粒，并将此纳米颗粒作为非病毒载体，投送到多种生物体内并实施基因编辑。随后，将麦角硫因的生物合成质粒通过同样的纳米粒子，导入上述基因改造的微生物体内。此项技术操作简单，成本低，兼容性和成功率高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于显著提高麦角硫因的微生物制造产率。为了实现此目的，本专利技术提供了一种麦角硫因的纳米生物制备方法，即利用纳米-基因编辑技术对微生物进行高效基因敲除，再利用纳米投递系统将质粒高效投递到微生物细胞体系内，从而改造微生物进行麦角硫因的高产生物制造。作为一个优选的技术方案，其制备方法包括：利用Nano-CRISPR系统对生产麦角硫因的微生物体系进行高效基因编辑，去除其体内潜在影响合成麦角硫因内源因子；同时，将麦角硫因的生物合成质粒通过同样的纳米粒子，导入上述基因改造后微生物体内，从而实现麦角硫因生物制造的高产化。具体过程示意图参见图1。所述的Nano-CRISPR系统为将CRISPR/Cas9系统负载于纳米粒子表面而成。优选地，所述的微生物包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，乳杆菌，棒状杆菌等在内的杆菌，酵母菌，霉菌，放线菌。优选地，所述的纳米粒子为纳米二氧化硅，纳米二氧化钛，纳米四氧化三铁，纳米碳颗粒，纳米量子点，纳米稀土氧化合物。优选地，Nano-CRISPR系统中所使用的纳米粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种麦角硫因的纳米生物制备方法，其特征在于：利用纳米‑基因编辑技术对微生物进行高效基因敲除，再利用纳米投递系统将质粒高效投递到微生物细胞体系内，从而改造微生物进行麦角硫因的高产生物制造。

【技术特征摘要】
1.一种麦角硫因的纳米生物制备方法，其特征在于：利用纳米-基因编辑技术对微生物进行高效基因敲除，再利用纳米投递系统将质粒高效投递到微生物细胞体系内，从而改造微生物进行麦角硫因的高产生物制造。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：利用Nano-CRISPR系统对生产麦角硫因的微生物体系进行高效基因编辑，去除其体内潜在影响合成麦角硫因内源因子；同时，将麦角硫因的生物合成质粒通过同样的纳米粒子导入上述基因改造后微生物体内，从而制造麦角硫因。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的Nano-CRISPR系统为将CRISPR/Cas9系统负载于纳米粒子表面而成。4.根据权利要求2-3之一所述的方法，其特征在于，所述微生物体内潜在影响合成麦角硫因的内源因子为谷胱甘肽合成酶。5.根据权利要求2-4之一所述的方法，其特征在于，该方法包括：(1)制备纳米粒子；(2)将纳米粒子悬浮在磷酸盐缓冲液内，而后与Cas9蛋白表达质粒以及能够高效敲除谷胱甘肽合成酶的向导RNA表达质粒进行充分混合，向其中加入微生物，培育一段时间后，向培养基中加入氨苄青霉素，进行对成功转染质粒细胞的筛选从而获得谷胱甘肽缺失型微生物细胞；(3)将纳米粒子...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶志敏，
申请(专利权)人：陶志敏，
类型：发明
国别省市：北京,11