一种绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法技术

本发明专利技术公开了一种绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法，包括如下步骤：(1)提取绵羊卵巢组织血管发生相关因子蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，再与缓冲液混合后高温变性，制备SDS‑PAGE凝胶，先分离胶灌胶密封凝聚，再加入浓缩胶，后加电泳缓冲液进行电泳；(2)电泳完成后找出目的蛋白凝胶，剪取PVDF膜，按照滤纸、PVDF膜、胶、滤纸由外向里的顺序置于转膜仪中，采用低温高压双层膜湿转膜进行对蛋白转印；(3)转膜结束后加入5％脱脂奶粉封闭液；(4)加入稀释后的一抗和二抗免疫反应；(5)显色。本发明专利技术采用低温高压双层膜湿转膜对绵羊卵巢组织血管发生相关蛋白进行转膜，提高了转膜效率，节省时间，洗膜后检测条带背景清晰且信号好。

An Immunoblotting Method for Detecting Vasculogenesis Related Factor Protein in Ovary of Sheep

【技术实现步骤摘要】
一种绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法
本专利技术属于生物医学基因检测
，尤其涉及一种绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法。
技术介绍
目前对于绵羊卵巢组织中的血管发生相关因子的结构生理功能在细胞、分子水平有较深入的研究，而对于这种研究，国内只是在核酸表达的量上进行一些机制的研究，很少去从蛋白的表达量上去进一步的验证。研究卵巢血管相关发生因子的作用机理，并进行分子层面准确性的相互验证，对于绵羊卵巢血管的发生、成熟和增生的生理作用有非常重要的意义。蛋白质作为大分子物质在绵羊机体中承担着组织的形成及修复更新，为机体提供营养物质和能量供机体新陈代谢来维持生命活动，更对血管的形成和增生发挥非常重要的作用。目前认为血管相关发生的因子主要有血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)家族和络氨酸激酶受体2(Tyrosine-proteinkinasereceptor，Tie2)在血管的形成过程的重要参与因子，其也在血管发展和成熟中发挥着调节作用。WesternBlot检测技术是将蛋白质样品经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到固相载体上，利用抗原抗体的特异性结合反应来检测目标蛋白的表达。VEGF能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性，Tie2特异性地表达于内皮细胞表面和某些造血祖细胞，它在机体血管生成活跃的部位主要参与血管网络的改建过程。目前，关于绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白检测方法的研究较少，蛋白的表达量不准确，因此，建立特异性检测绵羊卵巢相关发生因子蛋白的方法具有重要的价值。
技术实现思路
针对上述
技术介绍
中指出的不足，本专利技术提供了一种绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法，旨在解决上述
技术介绍
中现有技术存在的问题。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法，包括如下步骤：(1)提取目的蛋白及进行电泳：提取绵羊卵巢组织血管发生相关因子蛋白，采用BCA试剂盒测定所述蛋白浓度后分装于离心管中-80℃保存，制备SDS-PAGE凝胶，6％或12％分离胶灌胶后用乙醇密封，待分离胶凝聚，加入5％浓缩胶，按所述蛋白与5×SDS上样缓冲液在离心管中混合后，置于95℃水浴锅中变性10min，再与预染指示剂一同上样，加入1×电泳缓冲液，进行电泳；(2)转膜：电泳完成后，找出目的蛋白凝胶块并从玻璃板中取下，剪取PVDF膜，按照滤纸、PVDF膜、胶、滤纸由外向里的顺序排列于转膜仪中并清除所产生的气泡，采用低温高压双层膜湿转膜80V转膜75min或120V转膜90min；(3)封闭：转膜结束后加入5％脱脂奶粉封闭液室温摇床轻摇40min；(4)免疫反应：加入稀释后的一抗4℃条件下过夜10h～12h，用PBST洗去未结合的抗体，10min/次，漂洗3次；加入稀释后的二抗37℃恒温摇床孵育1h～2h，洗涤液洗去未结合的抗体，10min/次，漂洗5次；(5)显色：加入90～100μL底物发光液后显影定影，在X-胶片上中观察蛋白的表达。优选地，步骤(1)中，采用液氮研磨法和蛋白裂解液提取所述绵羊卵巢组织血管发生相关因子蛋白。优选地，步骤(1)中，所述电泳过程中，开始电泳时恒压40V，待样品跑至两胶分离处并充分压至线性时，将电压调至80V～100V，再继续电泳直至指示剂跑至凝胶底部。优选地，步骤(2)中，所述PVDF膜先经甲醇活化1min，再按顺序放入转膜仪中。优选地，步骤(4)中，所述一抗抗体经5％脱脂奶粉稀释的比例为1:500。优选地，步骤(4)中，所述二抗抗体经5％脱脂奶粉稀释的比例为1:3000。相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术在绵羊卵巢组织血管发生相关蛋白检测中采用低温湿转双层膜方法，相比传统的湿转膜方式，提高了转膜效率，防止蛋白转丢，节省时间；采用含有吐温的洗剂液(PBST)进行洗膜代替不含吐温的洗剂液(PBS)，检测条带背景清晰且信号更好；本专利技术所使用的一抗和二抗均用5％脱脂奶粉按照特定的比例稀释，使获取的蛋白条带无特异性杂带且背景较好，蛋白信号强，便于扫描和灰度值的获取。附图说明图1是本专利技术实施例一提供的显色图像。图2是本专利技术实施例二提供的显色图像。图3是本专利技术实施例三提供的显色图像。图中：1.敖汉细毛羊，2.湖羊，3.小尾寒羊。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例中所用试剂及材料均通过市场公开商业渠道购得，血管内皮生长因子(VEGF)抗体、酪氨酸激酶受体2(Tie2)抗体、β-肌动蛋白(β-Actin)、二抗(Goatanti-rabbitIgG/HRP)购自北京博奥森(Bioss)公司，其余试剂与仪器均购买自商业公开渠道。实施例一一种绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法，包括如下步骤：(1)分别提取敖汉细毛羊、湖羊、小尾寒羊的目的蛋白及进行电泳：采用液氮研磨法和蛋白裂解液提取分子量42kD绵羊卵巢组织β-肌动蛋白作为研究对象，测定蛋白浓度后分装于离心管中-80℃保存，制备SDS-PAGE凝胶，12％分离胶灌胶后用乙醇密封30min，待分离胶凝聚，加入5％浓缩胶聚合20min，按蛋白与5×SDS上样缓冲液在离心管中混合后，置于95℃水浴锅中变性10min，再与预染指示剂一同上样，总共检测3个蛋白样品，加入1×电泳缓冲液，开始电泳时恒压40V，待样品跑至两胶分离处并充分压至线性时，将电压调至80V，再继续电泳直至指示剂跑至凝胶底部2-3cm停止跑胶。(2)转膜：电泳完成后，找出目的蛋白凝胶块并从玻璃板中取下，剪取PVDF膜，PVDF膜先经甲醇活化1min，再按照滤纸、PVDF膜、胶、滤纸由外向里的顺序排列于转膜装置中并清除所产生的气泡，放入湿转膜仪中80V转印时间75min。(3)封闭：转膜结束后加入5％脱脂奶粉封闭液室温摇床轻摇40min。(4)免疫反应：加入经5％脱脂奶粉按比例1:1000稀释后的一抗4℃过夜12h，用PBST洗去未结合的抗体，10min/次，漂洗3次；加入经5％脱脂奶粉按比例1:2000稀释后的二抗室温孵育1h，洗涤液洗去未结合的抗体，10min/次，漂洗3次。(5)显色：加入90μL底物发光液室温反应30s，用X-胶片进行显影曝光来观察蛋白的表达，显色图像如图1A所示；图1B所示显色图像的获取方法同图1A，区别在于步骤(1)中12％分离胶和浓缩胶在制备过程混合均匀并放置室温中聚合40min，蛋白浓度测定采用考马斯亮蓝试剂，步骤(2)中放入湿转膜仪中80V转印75min；图1C所示显色图像的获取方法同图1B，区别在于步骤(1)中采用BCA试剂盒测定蛋白浓度；图1D所示显色图像的获取方法同图1C，区别在于步骤(2)中采用水中加冰降温高压使转膜仪工作，步骤(4)中一抗4℃过夜10h，二抗37℃孵育2h。由图1所示对绵羊卵巢组织β-肌动蛋白检测的结果可知，其中图1A为常规步骤要求进行操作，图1B采用配置分离胶和浓缩胶在未加入TEMED之前充分混匀，再配置完成后延长两种胶的聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取目的蛋白及进行电泳：提取绵羊卵巢组织血管发生相关因子蛋白，采用BCA试剂盒测定所述蛋白浓度后分装于离心管中‑80℃保存，制备SDS‑PAGE凝胶，6％或12％分离胶灌胶后用乙醇密封，待分离胶凝聚，加入5％浓缩胶，按所述蛋白与5×SDS上样缓冲液在离心管中混合后，置于95℃水浴锅中变性10min，再与预染指示剂一同上样，加入1×电泳缓冲液，进行电泳；(2)转膜：电泳完成后，找出目的蛋白凝胶块并从玻璃板中取下，剪取PVDF膜，按照滤纸、PVDF膜、胶、滤纸由外向里的顺序排列于转膜仪中并清除所产生的气泡，采用低温高压双层膜湿转膜80V转膜75min或120V转膜90min；(3)封闭：转膜结束后加入5％脱脂奶粉封闭液室温摇床轻摇40min；(4)免疫反应：加入稀释后的一抗4℃过夜10h，用PBST洗去未结合的抗体，10min/次，漂洗3次；加入稀释后的二抗37℃孵育2h，洗涤液洗去未结合的抗体，10min/次，漂洗5次；(5)显色：加入90～100μL底物发光液显影曝光，在X‑胶片上中观察蛋白的表达。

【技术特征摘要】
1.一种绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取目的蛋白及进行电泳：提取绵羊卵巢组织血管发生相关因子蛋白，采用BCA试剂盒测定所述蛋白浓度后分装于离心管中-80℃保存，制备SDS-PAGE凝胶，6％或12％分离胶灌胶后用乙醇密封，待分离胶凝聚，加入5％浓缩胶，按所述蛋白与5×SDS上样缓冲液在离心管中混合后，置于95℃水浴锅中变性10min，再与预染指示剂一同上样，加入1×电泳缓冲液，进行电泳；(2)转膜：电泳完成后，找出目的蛋白凝胶块并从玻璃板中取下，剪取PVDF膜，按照滤纸、PVDF膜、胶、滤纸由外向里的顺序排列于转膜仪中并清除所产生的气泡，采用低温高压双层膜湿转膜80V转膜75min或120V转膜90min；(3)封闭：转膜结束后加入5％脱脂奶粉封闭液室温摇床轻摇40min；(4)免疫反应：加入稀释后的一抗4℃过夜10h，用PBST洗去未结合的抗体，10min/次，漂洗3次；加入稀释后的二抗37℃孵育2h，洗涤液洗去未结合的抗体，10min/次，漂洗5次；(5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王欣荣，李明娜，郭亚军，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62