死亡相关蛋白激酶1在制备胃癌术后预后评估试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术提供了死亡相关蛋白激酶1在制备胃癌术后预后评估试剂盒中的新应用。本发明专利技术人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测死亡相关蛋白激酶1在胃癌组织中的相对表达量，能够判断胃癌患者出现胃癌复发转移的风险。本发明专利技术的有益效果主要体现在：本发明专利技术提供了死亡相关蛋白激酶1在制备胃癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断胃癌患者预后的蛋白质分子标记，对于胃癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。

Application of death-related protein kinase-1 in the preparation of prognostic assessment kit for gastric cancer after operation

【技术实现步骤摘要】
死亡相关蛋白激酶1在制备胃癌术后预后评估试剂盒中的应用
本专利技术涉及死亡相关蛋白激酶1在制备胃癌术后预后评估试剂盒中的应用。
技术介绍
胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位，胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高。好发年龄在50岁以上，男女发病率之比为2：1。由于饮食结构的改变、工作压力增大以及幽门螺杆菌的感染等原因，使得胃癌呈现年轻化倾向。胃癌可发生于胃的任何部位，其中半数以上发生于胃窦部，胃大弯、胃小弯及前后壁均可受累。绝大多数胃癌属于腺癌，早期无明显症状，或出现上腹不适、嗳气等非特异性症状，常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似，易被忽略，因此，目前我国胃癌的早期诊断率仍较低。胃癌的预后与胃癌的病理分期、部位、组织类型、生物学行为以及治疗措施有关。死亡相关蛋白激酶1是一种钙离子/钙调素调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，死亡相关蛋白激酶1可参与众多细胞内信号通路，调节细胞的增殖、凋亡、自噬、附着和失巢凋亡。从1995年发现至今，死亡相关蛋白激酶1在癌症、中风以及心血管疾病中的作用正逐渐被揭示。研究发现死亡相关蛋白激酶1在p53突变或者缺失的乳腺癌细胞中可以促进乳腺癌细胞的增殖，而在p53野生型细胞中死亡相关蛋白激酶1却促进细胞凋亡。在癌症早期，死亡相关蛋白激酶1可以通过抑制细胞转化来阻止癌细胞扩散。本专利技术研究发现在胃癌中的死亡相关蛋白激酶1表达与病人术后预后存在显著的关系，暗示死亡相关蛋白激酶1可作为胃癌的术后预后的有效预警蛋白。胃癌做为对人类健康威胁最大的肿瘤之一，至今其发生的分子机制仍不清楚，对其的治疗也缺少特异性的分子靶点，而死亡相关蛋白激酶1做为十分重要的肿瘤癌基因，目前尚无文献报道死亡相关蛋白激酶1与判断胃癌预后或胃癌转移相关。
技术实现思路
本专利技术目的是提供死亡相关蛋白激酶1在制备胃癌术后预后评估试剂盒中的新应用。本专利技术采用的技术方案是：死亡相关蛋白激酶1在制备胃癌术后预后评估试剂盒中的应用。本专利技术人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测死亡相关蛋白激酶1在胃癌组织中的相对表达量，能够判断胃癌患者出现胃癌复发转移的风险。基于死亡相关蛋白激酶1表达量与胃癌复发转移的相关性，以该蛋白作为预后标记物对其表达量进行检测可以用于指导胃癌的预后判断，因此可将死亡相关蛋白激酶1作为分子标记，利用死亡相关蛋白激酶1单克隆抗体或多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测死亡相关蛋白激酶1在胃癌组织中的相对表达量。所述试剂盒主要包括：人源死亡相关蛋白激酶1单克隆抗体或多克隆抗体、免疫组化实验试剂。所述免疫组化实验试剂为本领域免疫组化实验中的常用试剂。专利技术人在发现，死亡相关蛋白激酶1在复发转移胃癌组织中表达低于未复发转移胃癌组织，可以推测死亡相关蛋白激酶1在胃癌术后复发转移发挥重要作用。查阅国内外文献，死亡相关蛋白激酶1与胃癌的发生以及复发转移的相关研究少，在本实验中，死亡相关蛋白激酶1在胃癌组织中的表达下调，而在癌旁和正常胃组织中则表达上调，且与未复发转移组相比，死亡相关蛋白激酶1在复发转移组中表达也下调，表明死亡相关蛋白激酶1可能作为促进因子参与胃癌发生发展过程。通过Kaplan-Meier生存曲线分析，死亡相关蛋白激酶1表达程度与胃癌患者的预后有关，死亡相关蛋白激酶1低表达的患者预后不良(P<0.05)。综上所述，死亡相关蛋白激酶1在胃癌组织中低表达，死亡相关蛋白激酶1的低表达与胃癌患者术后复发转移有关。死亡相关蛋白激酶1可以作为胃癌预后的一个重要候选分子标记物。优选的，所述人源死亡相关蛋白激酶1多克隆抗体由序列为SEQIDNO.1所示的死亡相关蛋白激酶1免疫兔子获得，可自行制备，也可采用市购商品。具体的，所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％H2O2(水溶液)、3％BSA封闭液(以PBS配制)、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶(用于标记二抗)、PBS(pH7.4)、0.01MEDTA修复液。本专利技术所述试剂盒的使用方法如下：(a)病理标本来自于胃癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。(b)免疫组化方法利用SP染色法，具体步骤如下：(c)制备胃癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。(d)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯I：10min；二甲苯II：10min；二甲苯III：10min。(e)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇：3min。(f)PBS清洗3次，每次5min。(h)EDTA抗原高压修复：切片放入0.01MEDTA修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。PBS清洗3次，每次5min。(I)加入300μL的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。PBS清洗3次，每次5min。(J)加入300μL的3％(w/w)BSA封闭液(PBS配制)，37℃1h。PBS清洗3次，每次5min。(K)加入一抗：死亡相关蛋白激酶1抗体浓度：1：500，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后PBS洗4次，每次5min。(L)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。PBS洗4次，每次5min。(M)PBS洗3次，每次5min。DAB(DAB显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。(N)脱水。依次浸泡：75％乙醇:2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。(O)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。(P)利用显微镜和成像装置随机选取胃癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用AperioImageScope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms(PositivePixelCountV9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：(Q)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为Positivity×Log10[255/Iavg]，其中Positivity＝NPositive/NTotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；Iavg＝(Iwp+Ip+Isp)/(Nwp+Np+Nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。(L)采用SPSS18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用Pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用KaPlan-Meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。本专利技术显示死亡相关蛋白激酶1与胃癌的预后具有显著的相关性，为预测胃癌的复发转移及术后的生存率提供一条全新途径，对胃癌患者的预后有重要作用。当癌组织死亡相关蛋白激酶1免疫组化评分低于0.423时，胃癌易出现复发转移，胃癌患者术后易死亡。本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供了死亡相关蛋白激酶1在制备胃癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.死亡相关蛋白激酶1在制备胃癌术后预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：以死亡相关蛋白激酶1作为分子标记，利用人源死亡相关蛋白激酶1单克隆抗体或人源死亡相关蛋白激酶1多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测死亡相关蛋白激酶1在胃癌组织中的相对表达量。

【技术特征摘要】
1.死亡相关蛋白激酶1在制备胃癌术后预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：以死亡相关蛋白激酶1作为分子标记，利用人源死亡相关蛋白激酶1单克隆抗体或人源死亡相关蛋白激酶1多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测死亡相关蛋白激酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：林尧，王清水，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建,35