一种透明染色标本的制作方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种透明染色标本的制作方法及其应用，涉及生物技术领域。制作方法依次为：材料预处理、包括动物尸体的解剖；脱水固定、包括使用梯度浓度的乙醇溶液对中进行逐步脱水；软骨染色、用阿利新蓝染色液在对生物体进行软骨染色；肉的初次透明处理、将染色后的动物尸体标本使用KOH溶液进行浸泡处理；双氧水漂白、使用双氧水溶液进行浸泡漂白；梯度透明、使用配置的梯度透明液进行多次浸泡处理或使用水杨酸甲酯处理；装瓶保存、使用丙三醇里浸没处理并转移到容器里，再加麝香草酚颗粒即可。本发明专利技术的标本制备方法，在保证制备标本质量的基础上、缩短了传统标本的制作周期，从而提高了经济效益。

A Method for Making Transparent Stained Specimens and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种透明染色标本的制作方法及其应用
本专利技术属于
，特别是涉及一种透明染色标本的制作方法以及一种透明染色标本的应用。
技术介绍
1858年Beal研究人体的胚胎透明标本，1897年，Schulze利用茜素红、甘油、氢氧化钾(KOH)进行骨骼染色标本的制作，至今还有许多研究者进行优化改良，但目前相关文献并没有实质性解决透明骨骼标本中实际潜在的一些制作问题的出现，甚至未曾提及。实际透明骨骼标本制作实验之中，经常会出现错染或染色不完全的现象，使目标物不能很好有效的彰显，以至于标本骨骼结构显现不完整，观察研究时不便捷。同时对于不同大小脊柱动物，制作方法应该要存在一定的区别，但目前在相关文献中并无提及，尤其是配方校正，细化制作处理，包括肉的吸液膨胀问题及气泡问题，同时现有的标本制备方法存在制备周期长、制备比操作麻烦的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种透明染色标本的制作方法，在保证制备标本质量的基础上、缩短了传统标本的制作周期，从而提高了经济效益。为解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术为一种透明染色标本的制作方法，包括：步骤1、材料预处理：包括动物尸体的解剖：步骤2、脱水、固定：包括使用梯度浓度的乙醇溶液对中进行逐步脱水；步骤3、软骨染色：将阿利新蓝染色液在30℃下对生物体进行软骨染色；步骤4、肉的初次透明处理：将染色后的动物尸体标本使用KOH溶液进行浸泡，直到骨骼可见为止；步骤5、双氧水漂白：使用3％-5％的双氧水溶液进行浸泡漂白，祛除生物标本本身颜色；步骤6、梯度透明：使用配置的梯度透明液进行多次浸泡处理或使用水杨酸甲酯处理；步骤7、装瓶保存：制作好的透明骨骼成品在新的丙三醇里浸没1个小时，然后才能放到最终的容器里，然后加上少许麝香草酚颗粒即可。进一步地，所述步骤1材料预处理中的解剖包括：对于体型小于4cm的动物尸体需要去皮不去内脏；对于体型4-6cm的动物尸体需要去皮不去内脏但是需要将腹腔开口；对于体型大于6cm的动物尸体需要去皮去内脏；小于4cm的尸体不去皮不去内脏，因为材料本身较小，骨骼脆弱易断裂，去皮和去内脏必须手工去除，这样会增加失败率，即使去皮和去内脏对材料本身的美观性也没有明显的改变差异；因为它们的皮很薄，内脏很少，在KOH溶液透明时很容易被透明，也不影响溶液的渗透效果。4-6cm的尸体去皮不去内脏浸泡乙醇是因为，此时生物体的皮较厚，内脏较多，在美观性和渗透性上有一定的影响；去皮是因为，相对于在浸泡酒精后和没有浸泡酒精的情况下，没有浸泡酒精皮更容易去除，且去除的干净。不去内脏是因为，浸泡酒精后，因为脱水，内脏更容易完整的去除。大于6cm的去皮去内脏。去皮是因为没有浸泡酒精更好去除，去内脏是因为腹腔内水分太大，对于酒精脱水则需要更多的酒精和时间去脱水，所以直接去除内脏是有效的方法，不仅可以节约制作时间，而且可以节约试剂成本。同时还包括鱼类的鳞片、龟类的壳角质层、蜥蜴目的鳞片以及鳄鱼的皮甲的去除；其中，去除具体包括使用0.2-0.5％KOH碱溶液浸泡3-18h。其中，对于小型海鱼选择只去鳞不去皮，所述小型海鱼包括小丑鱼、三间火箭，因为小型海鱼本身不大且体型比较薄，所以渗透率足够染色及透明，保留皮质在一定程度上会有利于镊取过程中起到保护作用，防止镊取过程中使细小的骨骼变形断裂，同时能一定程度上减少因为换液带来离子浓度差的吸液涨破现象；其中，红肉在透明度上会低于白肉，为了达到高透明的效果，预处理过程中还需将红肉中的红色给去除，具体包括采用硼砂2份，浓度为5％的氨水1份和20份的蒸馏水混合液进行浸泡。进一步地，所述步骤2脱水、固定后还包括使用脂溶性溶剂进行浸泡脱脂；其中，所述脂溶性溶剂包括工业乙醇，乙酸异戊酯，汽油、丙酮、石油醚；其中，对于体型小于8cm的动物尸体选用乙酸异戊酯进行温度为30℃、时长4天的密封脱脂，盛放容器不可选用塑料制品；其中，对于体型≥8cm的动物尸体汽油、丙酮或石油醚进行温度为30℃、时长4天的密封脱脂，盛放容器不可选用塑料制品；其中，浸泡脱脂后还包括脂溶性溶剂的提取：所述脂溶性溶剂的提取包括使用水溶液或者乙醇溶液进行梯度稀释提取；使用乙醇溶液进行梯度稀释提取具体包括依次使用浓度为50％，75％，100％和100％的乙醇溶液进行浸泡提取。进一步地，所述步骤2的脱水、固定还可使用4％PFA多聚甲醛溶液浸泡固定或者10％福尔马林溶液进行浸泡固定；其中，所述4％PFA多聚甲醛溶液主要由多聚甲醛、磷酸盐、去离子水组成,pH为7.4；4％PFA多聚甲醛溶液适合于绝大多数组织和细胞的固定,是免疫组织化学和培养细胞固定中最常用的固定液之一,它能较好的保护组织和细胞的形态结构。4％PFA多聚甲醛溶液浸泡脱水方法包括：将预处理好的标本放入PFA溶液之中使标本完全浸没，根据标本的体型大小指定时间，一般的小标本泡制时间按2-4h浸泡，中小型的标本需要浸泡的时间一般为4-18h；为了防止溶液会挥发出甲醛，使用时在通风环境的条件下，使用温度为25-35℃。进一步地，所述步骤2中用梯度浓度的乙醇溶液对中进行逐步脱水具体包括：使用75％的乙醇溶液浸泡处理2天，每天更换乙醇溶液一次；使用95％的乙醇溶液或无水乙醇浸泡处理2天，每天更换乙醇溶液一次；使用无水乙醇浸泡处理3天；75％乙醇：杀菌消毒，过高浓度的酒精会在细菌表面形成一层保护膜，阻止酒精进入细胞体内，从而难以将细菌杀死；浓度过低，虽然可以进入细胞体内，但不能将蛋白质变性凝固，同样无法将细菌杀死。针对新鲜尸体和冷冻尸体起到一个脱水作用，对干尸起到一个初步补水的作用，不用纯水给干尸进行补水是防止干尸过分吸收水分，导致变形或烂掉。95％乙醇和无水乙醇的作用：脱去生物体内的水分以及固定形状。去除水分过后有利于脂溶性溶剂将体内的“脂”从体内脱除。进一步地，所述阿利新蓝染色液包括无水乙醇770毫升、蒸馏水70毫升，阿利新蓝0.1克，冰醋酸160毫升；阿利新蓝染色液配制方法：先用70毫升蒸馏水分成3份分别为25毫升、20毫升、25毫升，先取0.1克阿利新蓝送入到容器低端，然后加入25毫升蒸馏水，不断震荡，使阿利新蓝溶解，震荡1分钟后再加20毫升水进行震荡1分钟，最后再加25毫升进行最后的一次震荡；再与冰醋酸混合搅拌，最后混入酒精；阿利新蓝染色液的配置，先加水的原因是阿利新蓝易溶于水，而不容易在无水乙醇中溶解，分批次加水和比一次直接配置是能更好的解决一定的实际配置过程中阿利新蓝粉末粘附在容器内壁上的问题；对于如螃蟹、鳌虾、龙虾等节肢动物染色，需将节肢动物先在浓度为20％-30％的冰醋酸溶液中浸泡24h在进行阿利新蓝染色液的浸泡染色，冰醋酸溶液浸泡处理目的是便于下一步阿利新蓝染色液的染色更具有渗透力。在阿利新蓝染液的染色过程中，PH的调控极为重要，要确保PH为2.5，才是最佳的染色状态，因为组织内的羧基电离，带有一个负电荷，与阿利新蓝中的阳离子形成盐键，使带有羧基的酸性黏液物质(硫酸黏性蛋白和唾液黏性蛋白)染色，此染色在PH为2.5条件下最佳。在将生物材料浸泡过染色液之后，染液的PH会上升，导致第二次使用时无法染上色。基于反应原理，将通过调控PH值来使得染液可以重复使用。由于冰醋酸是弱酸，故而使用PH计进行配合调节PH，若在多次使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种透明染色标本的制作方法，其特征在于，包括：步骤1、材料预处理：包括动物尸体的解剖：步骤2、脱水、固定：包括使用梯度浓度的乙醇溶液对中进行逐步脱水；步骤3、软骨染色：将阿利新蓝染色液在30℃下对生物体进行软骨染色；步骤4、肉的初次透明处理：将染色后的动物尸体标本使用KOH溶液在23‑28℃的条件下进行浸泡，直到骨骼可见为止；步骤5、双氧水漂白：使用3％‑5％的双氧水溶液进行浸泡漂白；步骤6、梯度透明：使用配置的梯度透明液进行多次浸泡处理或使用水杨酸甲酯处理；步骤7、装瓶保存：制作好的透明骨骼成品在新的丙三醇里浸没1个小时，然后才能放到最终的容器里，然后加上少许麝香草酚颗粒即可。

【技术特征摘要】
1.一种透明染色标本的制作方法，其特征在于，包括：步骤1、材料预处理：包括动物尸体的解剖：步骤2、脱水、固定：包括使用梯度浓度的乙醇溶液对中进行逐步脱水；步骤3、软骨染色：将阿利新蓝染色液在30℃下对生物体进行软骨染色；步骤4、肉的初次透明处理：将染色后的动物尸体标本使用KOH溶液在23-28℃的条件下进行浸泡，直到骨骼可见为止；步骤5、双氧水漂白：使用3％-5％的双氧水溶液进行浸泡漂白；步骤6、梯度透明：使用配置的梯度透明液进行多次浸泡处理或使用水杨酸甲酯处理；步骤7、装瓶保存：制作好的透明骨骼成品在新的丙三醇里浸没1个小时，然后才能放到最终的容器里，然后加上少许麝香草酚颗粒即可。2.根据权利要求1所述的一种透明染色标本的制作方法，其特征在于，所述步骤1材料预处理中的解剖包括：对于体型小于4cm的动物尸体需要去皮不去内脏；对于体型4-6cm的动物尸体需要去皮不去内脏但是需要将腹腔开口；对于体型大于6cm的动物尸体需要去皮去内脏；同时还包括鱼类的鳞片、龟类的壳角质层、蜥蜴目的鳞片以及鳄鱼的皮甲的去除；其中，对于小型海鱼选择只去鳞不去皮，所述小型海鱼包括小丑鱼、三间火箭。3.根据权利要求1所述的一种透明染色标本的制作方法，其特征在于，所述步骤2脱水、固定后还包括使用脂溶性溶剂进行浸泡脱脂；其中，所述脂溶性溶剂包括工业乙醇，乙酸异戊酯，汽油、丙酮、石油醚；其中，浸泡脱脂后还包括脂溶性溶剂的提取：所述脂溶性溶剂的提取包括使用水溶液或者乙醇溶液进行梯度稀释提取；使用乙醇溶液进行梯度稀释提取具体包括依次使用浓度为50％，75％，100％和100％的乙醇溶液进行浸泡提取。4.根据权利要求1所述的一种透明染色标本的制作方法，其特征在于，所述步骤2的脱水、固定还可使用4％PFA多聚甲醛溶液浸泡固定或者10％福尔马林溶液进行浸泡固定；其中，所述4％PFA多聚甲醛溶液主要由多聚甲醛、磷酸盐、去离子水组成,pH为7.4。5.根据权利要求1所述的一种透明染色标本的制作方法，其特征在于，所述步骤2中用梯度浓度的乙醇溶液对中进行逐步脱水具体包括：使用75％的乙醇溶液浸泡处理2天，每天更换乙醇溶液一次；...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦家哲，
申请(专利权)人：秦家哲，
类型：发明
国别省市：安徽,34