一种化学诱导鲍异源三倍体的方法技术

一种化学诱导鲍异源三倍体的方法，涉及贝类的培育方法。1)种鲍的选择及促熟；2)人工催产；3)配子的选择和处理；4)同步受精；5)药物诱导；6)药物去除；7)孵化。确保同步受精：严格避免配子在排放过程中提前接触，镜检确认不存在意外受精，保证同步受精和受精卵发育的一致性。优化诱导条件：以时时镜检观察确定对照组受精卵PB1比例70％～80％作为处理时间节点，确保第一极体有效释放，避免出现四倍体和非整倍体。稳定高效的诱导率：三倍体诱导率为100％或接近于100％。

A method of chemical induction of allotriploid abalone

【技术实现步骤摘要】
一种化学诱导鲍异源三倍体的方法
本专利技术涉及贝类的培育方法，尤其涉及一种化学诱导鲍异源三倍体的方法。
技术介绍
鲍是名贵的海珍品，被誉为“海产八珍”之首。而我国作为世界第一养鲍大国，2017年全国鲍鱼总产量为14.85万吨，年产值超两百亿元。目前，我国鲍的主要养殖种类为皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)，养殖范围自我国北方黄渤海地区延伸至福建沿岸，其中福建省养殖产量高达至12.34万吨(2017年)，占全国鲍总产量的83.1％。然而，受皱纹盘鲍自身生活习性影响，位于亚热带福建海区的养殖鲍夏季多次爆发大规模死亡事件，当地渔民损失惨重。为规避风险，养殖户只能缩短养殖周期，致使商品规格小型化、抗逆性弱和品质不足等多种不良产业状况相继出现。此外，繁殖盛期的皱纹盘鲍性腺排放后体质虚弱，在环境胁迫下易导致死亡。上述困扰福建鲍鱼养殖产业发展的问题，亟需解决。杂交育种技术可实现种质改良的目的。绿鲍(H.fulgens)主要分布于美国和墨西哥太平洋沿岸，属暖水性种类，是北美地区的主要养殖鲍种之一。因其个体大，且具有较强的高温适应性，自20世纪90年代以来，先后由王子臣(1986)和许国军(1989)等从美国引种至中国，进行驯化、自繁等研究工作。自2011年厦门大学鲍育种课题组采用选育与种间杂交相结合，培育出皱纹盘鲍(♀)与绿鲍(♂)杂交新品系——“绿盘鲍”(品种登记号：GS-02-003-2018)。与双亲种相比，绿盘鲍在生长与存活上具有显著的超亲杂种优势，抗逆性显著增强。同时发现，绿盘鲍性腺发育和成熟存在相对滞后的现象，部分性腺发育良好的个体排放后死亡率增加。异源多倍体是指不同物种杂交产生的杂种后代经过染色体加倍形成的多倍体。从进化角度分析，异源多倍体要优于同源多倍体，因其拥有两个或两个以上不同物种的整套染色体组，因此具有更强的自然选择优势。与同源三倍体一样，异源三倍体也具有不育或者育性差的特点。目前对于贝类异源三倍体的诱导多以理化方法为主，如近江牡蛎(Crassostrea.ariakensis)×太平洋牡蛎(C.gigas)、栉孔扇贝(Chlamysfarrer)×虾夷扇贝(Patinopectenyessoensi)、栉孔扇贝×海湾扇贝(Argopectenirradians)、香港巨牡蛎(C.hongkongensis)×太平洋牡蛎、红鲍(H.rufescens)×绿鲍，皱纹盘鲍×杂色鲍等(ZhangY,ZhangY,WangZ,etal.PhenotypictraitanalysisofdiploidandtriploidhybridsfromfemaleCrassostreahongkongensis×maleC.gigas[J].Aquaculture,2014,434:307-314.)。其中红鲍(♀)×绿鲍(♂)采用0.5mg/L的CB诱导，诱导率为69％～91％(Hernandez-IbarraNK,MorelosRM,CruzP,etal.AllotriploidGenotypicAssignmentinAbaloneLarvaebyDetectionofMicrosatellite-RecombinantGenotypes[J].JournalofHeredity,2010,101(4):476-490.)，皱纹盘鲍(♀)×杂色鲍(♂)采用0.6mg/L的CB诱导，三倍体率最高为48.11％(胡家财,郭炳坚,顾勇杰,等.诱导异源三倍体鲍的初步研究[J].水产养殖,2011,32(1):38-42.)，杂色鲍(♀)×皱纹盘鲍(♂)经0.4mg/L的CB诱导后，异源三倍体最高则为50.96％(张红云,严正凛,顾勇杰.细胞松弛素B诱导鲍异源三倍体[J].集美大学学报(自然版),2010,15(6):414-419.)。然而对于皱纹盘鲍(♀)与绿鲍(♂)异源三倍体的诱导工作，国内外尚未开展研究。同时贝类异源三倍体育种也存在诱导条件不成熟、诱导率低、诱导效果不稳定，诱导因素影响胚胎发育和幼体存活等问题，解决上述因素将有利于该项技术的推广与应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供将杂交育种与多倍体育种技术相结合的一种化学诱导鲍异源三倍体的方法。本专利技术包括以下步骤：1)种鲍的选择及促熟；在步骤1)中，所述种鲍的选择及促熟的具体方法可为：取个体活力良好且无外部损伤的皱纹盘鲍(♀)与绿鲍(♂)作为种鲍，分别放置于亲鲍培育池中促熟；所述种鲍可为2～3龄皱纹盘鲍，种鲍的壳长大于70mm，体重大于50g；所述亲鲍培育池内性别特征必须单一，亲鲍培育池内海水的温度可为24～26℃。2)人工催产；在步骤2)中，所述人工催产的具体方法可为：采用阴干结合紫外线照射海水的方法对性腺发育成熟的个体进行催产，直至种鲍分别产卵和排精为止；所述阴干的方法可为阴干60～120min后，将雌雄个体严格区分置于标记清楚的不同容器中，注入照射强度为500～1200mWh/L紫外线处理海水，每隔60min更换一次直至配子排放，期间注意防止意外受精。3)配子的选择和处理；在步骤3)中，所述配子的选择和处理的方法可为：使用150μm的筛绢滤除步骤2)配子中的杂质，镜检确定卵子质量和精子活力；所述镜检可为镜检质量高的卵液中卵子应卵膜完整、形状规则且不存在意外受精，活力好的精子应活动性和分散度良好。4)同步受精；在步骤4)中，所述同步受精的方法可为：将上述步骤3)中确定的活力好和质量高的精子和卵子混合，分为处理组和对照组，精子与卵子的质量比(15～20)︰1；所述受精的温度可为20～22℃，盐度可为30～35。5)药物诱导；在步骤5)中，所述药物诱导的具体方法可为：观察对照组受精卵发育情况，第一极体出现比例为50％～80％时，迅速将处理组内受精卵加入至浓度为1.50～1.75mg/L的CB诱导液中处理15～20min或30～40mg/L的6-DMAP诱导液处理10～15min；所述第一极体的观察应时时取样置于显微镜下观测；所述CB诱导液可为CB溶于DMSO所配制的1mg/mL的储存液稀释获得，所述6-DMAP诱导液可为6-DMAP溶于DMSO所配制的50mg/mL的储存液稀释获得。6)药物去除；在步骤6)中，所述药物去除的方法可为：药物处理后将受精卵置于1％的二甲基亚砜(DMSO)中清洗2次，每次15min。7)孵化。在步骤7中，所述孵化的方法可为：按照常规孵化及后期培育方法进行，使用流式细胞仪确定面盘幼虫三倍体率。本专利技术具有以下突出的技术效果：1、确保同步受精：严格避免配子在排放过程中提前接触，镜检确认不存在意外受精，保证同步受精和受精卵发育的一致性。2、优化诱导条件：以时时镜检观察确定对照组受精卵PB1比例70％～80％作为处理时间节点，确保第一极体有效释放，避免出现四倍体和非整倍体。3、稳定高效的诱导率：现有贝类异源三倍体诱导率在40％～90％间变化，而本专利技术的三倍体诱导率为100％或接近于100％，不同药物诱导皱纹盘鲍(♀)×绿鲍(♂)三倍体试验结果见表1所示。表1具体实施方式以下实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例11)取个体活力良好、无外部损伤的皱纹盘鲍和绿鲍做为种鲍，皱纹盘鲍(♀)平均壳长76.09±9.57mm本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化学诱导鲍异源三倍体的方法，其特征在于包括以下步骤：1)种鲍的选择及促熟；2)人工催产；3)配子的选择和处理；4)同步受精；5)药物诱导；6)药物去除；7)孵化。

【技术特征摘要】
1.一种化学诱导鲍异源三倍体的方法，其特征在于包括以下步骤：1)种鲍的选择及促熟；2)人工催产；3)配子的选择和处理；4)同步受精；5)药物诱导；6)药物去除；7)孵化。2.如权利要求1所述一种化学诱导鲍异源三倍体的方法，其特征在于在步骤1)中，所述种鲍的选择及促熟的具体方法为：取个体活力良好且无外部损伤的皱纹盘鲍(♀)与绿鲍(♂)作为种鲍，分别放置于亲鲍培育池中促熟；所述种鲍为2～3龄皱纹盘鲍，种鲍的壳长大于70mm，体重大于50g；所述亲鲍培育池内性别特征必须单一，亲鲍培育池内海水的温度为24～26℃。3.如权利要求1所述一种化学诱导鲍异源三倍体的方法，其特征在于在步骤2)中，所述人工催产的具体方法为：采用阴干结合紫外线照射海水的方法对性腺发育成熟的个体进行催产，直至种鲍分别产卵和排精为止。4.如权利要求3所述一种化学诱导鲍异源三倍体的方法，其特征在于所述阴干的方法为阴干60～120min后，将雌雄个体严格区分置于标记清楚的不同容器中，注入照射强度为500～1200mWh/L紫外线处理海水，每隔60min更换一次直至配子排放，期间注意防止意外受精。5.如权利要求1所述一种化学诱导鲍异源三倍体的方法，其特征在于在步骤3)中，所述配子的选择和处理的方法为：使用150μm的筛绢滤除步骤2)配子中的杂质，镜检确定卵子质量和精子活力；所述镜检为镜检质量高的卵液中卵子应卵膜完整、形状规则且不存在意外受...

【专利技术属性】
技术研发人员：王怡，骆轩，游伟伟，柯才焕，王星泽，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35