利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法，利用了DNA与RNA碱基互补配对原则，首先，设计了具有发夹结构的功能探针，当目标物（待测样品microRNA）存在时，特异性核酸内切酶（DSN酶）切割DNA‑RNA杂交体的DNA部分得到8‑17DNAzyme。然后，8‑17DNAzyme能特异性识别固定在电极表面的H2序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点进行切割。最后，电极表面被DNAzyme特异性切割后与电极表面相连的DNA序列依次与序列Link1、Link2、H3和H4自组装形成电化学生物传感器用于目标检测。所建立的方法灵敏度高，可用于复杂体系的microRNA的直接检测。

Preparation of DNA Self-assembled Electrochemical Biosensor Using DSN Enzyme and DNA Enzyme

【技术实现步骤摘要】
利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法
本专利技术涉及电化学检测
，具体提供了一种利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法。
技术介绍
microRNA是一种小的非蛋白编码RNA分子，通过与靶mRNA中的合成序列结合，从而抑制转录后基因表达。microRNA在许多生物学过程中发挥着重要的作用，并与各种疾病，尤其是癌症相关。microRNA被认为是癌症诊断、预后和治疗监测的潜在生物标志物。因此，开发灵敏度高、选择性好的检测策略是生物医学研究的迫切需求，尤其是对癌症的早期诊断和药物新靶点的发现有重要意义。目前，microRNA的传统检测方法主要有三种，定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)、诺瑟杂交（Northernblot）和高通量测序。qRT-PCR方法基于基因扩增阳离子技术，具有较高的检测灵敏度，但由于抑制剂、热误差和标本间交叉污染等直接影响检测结果的准确性，限制了qRT-PCR的进一步应用。而northernblotting和高通量测序，则需要进行一系列复杂的操作，耗时长，且检测灵敏度较低。本专利技术公开了一种超灵敏的检测方法，利用双特异性核酸内切酶及和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法，并将其应用于肿瘤标志物microRNA的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用双特异性核酸内切酶（DSN酶）和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法，并将其应用于肿瘤标志物microRNA的检测方法。所述方法是通过便捷，灵敏的信号放大策略，利用特异性核酸内切酶（DSN酶）和DNAzyme的特异性切割后进行DNA自组装形成电化学生物传感器用于目标检测。所建立的方法具有高的灵敏度，可用于复杂体系的microRNA的直接检测。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：包括以下步骤：首先设计能与目标microRNA碱基互补配对且含8-17DNAzyme序列的双功能探针H1；双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分，H1探针被切割得到8-17DNAzyme序列，而microRNA被释放出来继续与未反应的H1探针杂交循环切割，实现第一次目标循环；然后将发夹探针H2固定在金电极上；当金属离子存在时，前述8-17DNAzyme会特异性识别H2序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点并特异性切割，H2探针被切断成两部分，一部分与电极相连，一部分为游离的碱基序列，同时释放8-17DNAzyme继续切割未反应的电极表面的H2探针实现第二次循环放大；电极表面的H2被DNAzyme切断后，依然有部分碱基序列固定在电极表面上，这部分碱基序列会与连接探针Link1和Link2、杂交探针H3和H4进行自组装，形成一条dsDNA链；最后，六氨合钌通过静电作用吸附在dsDNA骨架上，通过检测六氨合钌的电化学信号，实现对microRNA的超灵敏检测。具体步骤为：（1）针对目标microRNA设计功能探针H1，所述探针为发夹结构的DNA探针，序列结构为从5'端到3'端依次为颈部1、环部1、环部2、环部3、颈部2序列。所述的第一部分为自由序列颈部1和环部1序列，所述的第二部分环部2为能特异性识别目标microRNA并与之杂交的序列，所述第三组成部分环部3和颈部2碱基序列为8-17DNAzyme，能在金属Mg2+离子存在时，特异性识别固定在电极表面的捕获探针H2（该发夹探针5'端修饰巯基）并切割序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点。（2）双特异性核酸内切酶（DSN酶）特异性切割：将6μL含有不同浓度microRNA的DSN缓冲液加入装有4μL5μM的双功能探针H1溶液的微量离心管中反应120min（其中DSN缓冲液包含：0.2UDSN，50mMTris-HCl，10mMMgCl2，1mMDTT，pH8.0），使双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分，得到8-17DNAzyme序列，并释放microRNA继续与其余未反应的H1探针杂交循环切割，实现目标循环放大。（3）电极预处理：将直径为2mm的金电极在新配制的食人鱼溶液（98％硫酸和30％双氧水按3：1的体积混合）浸泡，然后依次用0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末在抛光绒布打磨，然后用超纯水冲洗干净，分别在乙醇和超纯水中超声清洗5min，然后将电极置于0.5M的H2SO4溶液中，在-0.35-1.6V电位下扫描，直到在0.95V左右出现一个尖锐的还原峰，在0.12-0.14V范围内出现三个小的、连续的氧化峰，用超纯水冲洗电极，氮气吹干，备用。（4）捕获探针H2的固定：在9μL含有500mMNaCl、1mMEDTA、10mMTCEP的pH8.0、10mMTris-HCl缓冲液中加入1μL10μM捕获探针H2溶液，得到捕获探针H2固定液。将捕获探针H2固定液滴加到金电极表面，室温孵育120min，H2可通过S-Au键固定在电极表面，再用10mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面，氮气吹干。（5）电极表面空白位点封闭：将10μL2μM的疏基己醇溶液滴加到步骤（4）所得电极表面，室温孵育120min，封闭电极表面的非特异性活性位点，用10mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面，氮气吹干。（6）8-17DNAzyme的切割循环：将步骤（2）微量离心管中的溶液滴加于步骤（5）处理好的电极表面，孵育90min，用10mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗，氮气吹干。步骤（2）反应得到的8-17DNAzyme序列可以在金属Mg2+离子存在时，特异性识别固定在电极表面的H2探针形成杂交体，切割H2序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点，H2探针被切断成两部分，一部分与电极相连，一部分为游离的碱基序列，不再与8-17DNAzyme结合，游离的8-17DNAzyme继续切割未反应的电极表面H2探针，实现第二次循环放大。（7）DNA自组装电化学生物传感器的构建：电极表面的H2被DNAzyme切断后，依然有部分碱基序列固定在电极表面上，这部分碱基序列会与连接探针Link1和Link2、杂交探针H3和H4进行自组装，形成一条dsDNA链。具体操作是将步骤（6）得到的电极用10mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗吹干后，依次在电极表面滴加10μL含有1μM连接探针Link1缓冲液，10μL1μM的连接探针Link2缓冲液，10μL含有0.5μMH3和0.5μMH4的杂交探针缓冲液，分别反应90min、90min和120min，超纯水冲洗，氮气吹干。（8）电化学检测microRNA信号：将含有10μM六氨合钌的电化学检测液通氮气，步骤（7）所得电极置于电化学工作检测液中，电化学工作站在-0.6-0V电势范围内用方波伏安法扫描。DNA预处理：所有探针在使用前要经过预处理。处理方法为将装有DNA序列的微量离心管在离心机中5000rpm，离心5min，加入适量默克水，得到DNA浓度为100μM的溶液，再用pH为8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至10μM。具有发夹结构的DNA均在95℃加热5min，然后插入冰中半小时，使探针形成发夹结构。双功能探针H1溶液的制备：5μL10μM的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先设计能与目标microRNA碱基互补配对且含8‑17DNAzyme序列的双功能探针H1；双特异性核酸内切酶特异性切割DNA‑RNA杂交的DNA部分， H1探针被切割得到游离的8‑17DNAzyme序列，而microRNA被释放出来继续与未反应H1探针杂交循环切割，实现第一次目标循环；然后将发夹探针H2固定在金电极上；当金属离子存在时，前述8‑17DNAzyme会特异性识别H2 序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点并特异性切割，H2探针被切断成两部分，一部分与电极相连，一部分为游离的碱基序列，同时释放8‑17DNAzyme继续切割未反应的电极表面的H2探针实现第二次循环放大；电极表面的H2被DNAzyme切断后，依然有部分碱基序列固定在电极表面上，这部分碱基序列会与连接探针Link1和Link2、杂交探针H3和H4进行自组装，形成一条dsDNA链；最后，六氨合钌通过静电作用吸附在dsDNA骨架上，通过检测六氨合钌的电化学信号，实现对microRNA的超灵敏检测。

【技术特征摘要】
1.一种利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先设计能与目标microRNA碱基互补配对且含8-17DNAzyme序列的双功能探针H1；双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分，H1探针被切割得到游离的8-17DNAzyme序列，而microRNA被释放出来继续与未反应H1探针杂交循环切割，实现第一次目标循环；然后将发夹探针H2固定在金电极上；当金属离子存在时，前述8-17DNAzyme会特异性识别H2序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点并特异性切割，H2探针被切断成两部分，一部分与电极相连，一部分为游离的碱基序列，同时释放8-17DNAzyme继续切割未反应的电极表面的H2探针实现第二次循环放大；电极表面的H2被DNAzyme切断后，依然有部分碱基序列固定在电极表面上，这部分碱基序列会与连接探针Link1和Link2、杂交探针H3和H4进行自组装，形成一条dsDNA链；最后，六氨合钌通过静电作用吸附在dsDNA骨架上，通过检测六氨合钌的电化学信号，实现对microRNA的超灵敏检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）针对目标microRNA设计双功能探针H1，所述探针为发夹结构的DNA探针；设计固定在电极表面的探针H2，该发夹探针5'端修饰巯基；（2）双特异性核酸内切酶（DSN酶）特异性切割：将6μL含有不同浓度microRNA的DSN缓冲液加入装有4μL5μM的双功能探针H1溶液的微量离心管中反应120min；使双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分，得到8-17DNAzyme序列，并释放microRNA继续与其余未反应的H1探针杂交循环切割，实现目标循环放大；其中DSN缓冲液包含：0.2UDSN，50mMTris-HCl，10mMMgCl2，1mMDTT，pH8.0；（3）电极预处理：将直径为2mm的金电极在新配制的食人鱼溶液浸泡，然后依次用0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末在抛光绒布打磨，然后用超纯水冲洗干净，分别在乙醇和超纯水中超声清洗5min，然后将电极置于0.5M的H2SO4溶液中，在-0.35-1.6V电位下扫描，直到在0.95V出现一个尖锐的还原峰，在0.12-0.14V范围内出现三个小的、连续的氧化峰，用超纯水冲洗电极，氮气吹干，备用；食人鱼溶液为98％硫酸和30％双氧水按3：1的体积混合；（4）捕获探针H2的固定：在9μL含有500mMNaCl、1mMEDTA、10...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宪，李璟，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35