一种需钠弧菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种需钠弧菌及其应用，属于微生物领域。本发明专利技术提供的需钠弧菌V.natriegens SK42.001生长迅速，携带天然质粒并且能够表达外源基因，具有作为新型模式生物的开发价值和应用潜力。同时，该菌株含有编码褐藻胶裂解酶的基因、编码寡褐藻胶裂解酶的基因，还可用于生产制备褐藻寡糖相关产品。

A Vibrio Na Demand and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种需钠弧菌及其应用
本专利技术涉及一种需钠弧菌及其应用，属于微生物领域。
技术介绍
需钠弧菌Vibrionatriegens是已知生长速度最快的细菌，在一定条件下传代时间小于10分钟，生长速度比传统模式生物大肠杆菌Escherichiacoli快近一倍，因此无论是在科学研究还是工业生产中，需钠弧菌的应用都将大大节省时间成本，是一种潜力巨大可取代大肠杆菌的新型模式生物。哈佛大学遗传学家GeorgeChurch等课题组在2016年接连发表相关研究论文，指出需钠弧菌相比于大肠杆菌的优越性及其作为新型模式生物的可行性，并开发了相关基因组编辑工具，为促进该菌的宿主系统构建和改造提供了理论基础和技术支持，而国内目前未见相关报道。
技术实现思路
本专利技术从海泥中筛选到一株生长迅速的野生菌株，经鉴定命名为需钠弧菌VibrionatriegensSK42.001，于2017年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCM2017011。本专利技术所述需钠弧菌VibrionatriegensSK42.001具有以下特性：(1)生长迅速，是参照菌株大肠杆菌E.coliBL21的将近两倍；在NaCl浓度为3％的LB培养基中，需钠弧菌SK42.001的培养代时为16.2min，而E.coliBL21代时则为31.4min；SK42.001在LB平板划线培养5小时后即长出单菌落，而E.coliBL21则需要10小时；(2)含有自身天然质粒，大小约为3000bp；(3)可以水解明胶，能利用淀粉、麦芽糖；(4)好氧生长；(5)含有编码褐藻胶裂解酶的基因(SEQIDNO.2)、含有编码寡褐藻胶裂解酶的基因(SEQIDNO.3)；(6)含有的一些蛋白的编码基因与其他需钠弧菌株系不同，如黄原胶裂解酶、菌毛蛋白TadC、TadE、CpaB等。本专利技术所述需钠弧菌VibrionatriegensSK42.001，可以在LB培养基或者NaCl浓度为3％的LB培养基中生长，或者在配方为：海藻酸钠5g、(NH4)2SO45g、NaCl30g、MgS04·7H2O1g、K2HPO42g、FeSO4·7H2O0.01g，蒸馏水1000mL，pH7.2的培养基中生长。本专利技术提供的需钠弧菌V.natriegensSK42.001生长迅速，携带天然质粒并且能够表达外源基因，具有作为新型模式生物的开发价值和应用潜力。同时，该菌株含有编码褐藻胶裂解酶的基因、编码寡褐藻胶裂解酶的基因，还可用于生产制备褐藻寡糖相关产品。生物材料保藏需钠弧菌VibrionatriegensSK42.001，于2017年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2017011。附图说明图1菌株SK42.001显微镜(1000X)观察照片，图2菌株SK42.001的平板菌落形态，图3电镜(20000X)观察照片，图4V.natriegensSK42.001和E.coliBL21的生长曲线，图5重组质粒pAWP89-GFP-Cm，图6SK42.001接合重组菌表达GFP。图7M，DL5000marker；1，SK42.001野生菌中提取的天然质粒，图中质粒呈现超螺旋结构，条带在实际大小1/2的位置。图8需钠弧菌SK42.001的黄原胶裂解酶基因与V.natriegensCCUG16374的黄原胶裂解酶基因的比较。图9需钠弧菌SK42.001的菌毛组装蛋白TadC基因与V.natriegensCCUG16374的菌毛组装蛋白TadC基因的比较。图10需钠弧菌SK42.001的菌毛合成蛋白TadE基因与V.natriegensCCUG16374的菌毛合成蛋白TadE基因的比较。图11需钠弧菌SK42.001的菌毛Flp型组装蛋白CpaB基因与V.natriegensCCUG16374的菌毛Flp型组装蛋白CpaB基因的比较。具体实施方式培养基：液体培养基、筛选液体培养基：海藻酸钠5g、(NH4)2SO45g、NaCl30g、MgS04·7H2O1g、K2HPO42g、FeSO4·7H2O0.01g，蒸馏水1000mL，pH7.2。平板培养基：海藻酸钠5g、(NH4)2SO45g、NaCl30g、MgS04·7H2O1g、K2HPO42g、FeSO4·7H2O0.01g，蒸馏水1000mL，pH7.2，琼脂20g。实施例1需钠弧菌Vibrionatriegens的筛选方法(1)从山东省荣成市海带养殖厂附近对海泥进行采样，取1g样品在50mL无菌水中分散均匀。(2)取1mL上清液接种于50mL筛选液体培养基中，28℃、200rpm培养2天，稀释10-6并涂布于筛选平板培养基上，28℃培养2天，挑取不同形态单菌落经多次平板划线，获得纯培养物。(3)挑取不同形态单菌落，接种于液体培养基中，28℃、200rpm培养2天，取上清液测定菌株酶活，选取酶活较高菌株，委托中国典型培养物保藏中心保藏，并对该菌株的形态特征、生理生化特征及16SrDNA序列进行分析。实施例2需钠弧菌Vibrionatriegens的鉴定(1)平板菌落形态如图2所示，需钠弧菌SK42.001的平板菌落形态：划线于平板培养基上迅速生长，28℃培养24h后长出单菌落，菌落呈圆形凸起、乳白色、湿润略黏、表面光滑、边缘平整、直径约0.6～0.8cm。(2)电镜下的菌体特征如图3所示，需钠弧菌SK42.001在电镜下的菌体特征：菌体短小，两端钝圆，弯曲成弧状，大小为0.6～0.8μm×1.2～1.4μm。(3)生理生化特征需钠弧菌SK42.001的生理生化特征：如图1、表1、表2所示，需钠弧菌是革兰氏染色阴性，好氧生长，吲哚反应阴性，可水解明胶并微弱水解七叶灵，不能水解精氨酸、尿素和β-半乳糖苷，可利用葡萄糖、蔗糖、淀粉、阿拉伯糖、甘露糖，不能利用果糖、麦芽糖、菊糖、木糖、半乳糖、山梨糖、木糖醇。特别的是，本专利技术提供的需钠弧菌可以水解明胶，能利用淀粉、麦芽糖。需钠弧菌SK42.001的16SrDNA(SEQIDNO.1)与NCBI数据库中的数据进行比对，结果表明与需钠弧菌同源性极高。表1菌株SK42.001生理生化特性–酶活、碳源氧化+：阳性反应；-：阴性反应表2菌株SK42.001生理生化特性—利用碳源产酸+：阳性反应；-：阴性反应；w：弱阳性反应实施例3需钠弧菌Vibrionatriegens作为新型模式生物的可行性(1)生长速度测定在LB3液体培养基(NaCl浓度为3％的LB培养基)中培养代时为16.2min，而参照菌株E.coliBL21代时则为31.4min(图4)；SK42.001在LB平板划线培养5小时后即长出单菌落，而E.coliBL21则需要10小时。说明SK42.001生长迅速，约是E.coli的二倍。(2)SK42.001表达外源基因的可行性选用广宿主质粒pAWP89，构建含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因和氯霉素(Cm)抗性基因筛选标记的重组质粒pAWP89-GFP-Cm(图5)，采用pRK2013辅助质粒，通过三亲接合将pAWP89-GFP-Cm导入SK42.001，接合后的SK42.001重组菌在蓝光激发下发出绿色荧光(图6)。说本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.需钠弧菌(Vibrio natriegens)SK42.001，于2017年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2017011。

【技术特征摘要】
1.需钠弧菌(Vibrionatriegens)SK42.001，于2017年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2017011。2.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，来源于权利要求1所述需钠弧菌(Vibrionatriegens)SK42.001。3.根据权利要求2所述的一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，编码该酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.一种寡褐藻胶裂解酶，其特征在于，来源于权利要求1所述需钠弧菌(Vibrionatriegens)SK42.001。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：江波，张涛，孟青，陈静静，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32