类器官组织工程制造技术

本发明专利技术涉及用于开发和维持类器官的方法和由此产生的类器官。

Organ-like tissue engineering

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】类器官组织工程专利
本专利技术涉及开发和维持类器官的方法和由此产生的类器官。
技术介绍
与干细胞密切相关的两个特性是它们自我更新和产生特异的后代的能力。过去二十年的研究还表明，干细胞及其后代具有自组织的先天倾向，从而在过程中产生复杂的结构，使人想到那些驱动组织和器官发育的过程。模拟早期胚胎发育和模式的各个方面的胚胎体、多能干细胞聚集体部分说明了干细胞的自组织能力。然而，这种自组织潜能可能最好通过上皮类器官、多能或成体干细胞衍生的三维(3D)结构展现，该结构以先前体外模型无法比拟的保真度捕获真实器官的多种组织学和功能方面。目前，已经建立了多种器官(包括肠、胃、结肠、胰腺、视网膜、脑和肾)的类器官模型。从成体的或诱导的多能人干细胞产生类器官的能力为人类发育和疾病的建模、药物发现和个性化医疗提供了先前难以想象的可能性。此外，通过用作用于修复受损或患病器官的高度组织化的和功能性组织的来源，类器官有望显著推进组织工程和基于细胞的疗法领域。可通过在3D基质支架内组织特异性细胞的增殖和分化在体外形成类器官。已经尝试通过限制它们的生长来提高类器官作为体外组织模型的相关性。特别地，已经开发了模拟特定组织(例如肠绒毛)的几何结构的支架。这些支架内细胞的分化取得了各种各样的成功。胃肠的类器官展示出特别高水平的多细胞组织和广泛的应用，包括作为肠干细胞(ISC)生态位模型、肠发育和疾病模型、用于药物筛选和个性化医疗的平台及用于临床使用的可移植组织的来源。然而，肠的类器官形成的过程很大程度上是随机的，并且所得结构在多个方面与天然器官不同。值得注意的是，不能控制隐窝样结构域的位置、大小和数量，而绒毛结构完全不存在。此外，在没有间充质隔室下，构成这些结构的模式和自组织的机制尚不完全清楚。如下所述，在支架内或支架上使反映体内组织结构的类器官生长已经进行了许多尝试。Costello等(Costello等，2014)提供合成的3D水凝胶支架，用于支持肠上皮细胞系(Caco-2细胞和HT29-MTX)以及来自小鼠小肠的分离的隐窝细胞的生长。使用绒毛阵列的琼脂糖模具，由多孔聚乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)形成支架(Costello等，图1)。接种到这些支架中的分离的隐窝细胞分化，以形成帕内特细胞、杯状细胞和肠上皮细胞的空间排列(第1230页，第1栏，第1段)。该方法依赖于含有存在于分离的隐窝中的多种细胞类型的起始培养物，或依赖于上皮细胞系的增殖和自发分化能力。陈等(Chen等，2015)描述了在基于丝的多孔支架的表面上的肠上皮细胞系Caco-2细胞和HT29-MTX以及原代人肠肌成纤维细胞(H-InMyoFib)的生长。支架是管状型，具有或不具有内螺旋模式。在H-InMyoFib存在下在支架上生长的Caco-2细胞和HT29-MTX细胞形成极化柱状结构。因此，该方法也依赖于上皮细胞系。Levin等(Levin等，2013)描述了使用由聚L-乳酸密封并涂有胶原的非织物聚羟基乙酸圆柱形成的合成支架(第131页，第2段)。在该方法中，将从肠组织分离的类器官装载到支架上，并直接植入动物受试者中(第131页，第3段)。因此，Levin没有提供在体外使类器官生长的方法。Finkbeiner等(Finkbeiner等，2015)提供了由脱细胞小肠形成的支架(Finkbeiner等，图1B)。用人肠类器官将这些天然支架重新接种，在体外培养，然后移植到免疫受损的小鼠中。Finkbeiner还提供合成的聚羟基乙酸/胶原支架，在其上接种类器官，然后将支架立即植入小鼠中(Finkbeiner等，图1C)。作者表明合成支架可以在体内支持类器官存活分化，但不支持体外，同时脱细胞小肠支架支持类器官存活，但不提供用于干细胞分化的必要诱因(Finkbeiner等，图3C和3D)。因此，Finkbeiner没有提供用于体外在支架上生长和维持类器官的方法。JP2014/138605(Mongens等，2014)描述了用于在具有限定的表面形貌(第[0018]段)的生物可相容的材料的结构中使干细胞生长的方法，例如覆盖在微突起中的表面。主要通过为细胞粘附提供更大的表面积而选择结构，以促进未分化干细胞的生长(第[0025]段)和/或干细胞的大规模和统一分化(第[0029]和[0051]段)。然后能够收获分化的细胞并用于各种应用。Mongens公开的方法因此不适用于类器官领域，因为Mongens的目的是避免形态发育，并且反而是促进统一的生长和分化。最近的许多研究已经证明了在微孔内体外类器官的生长。然而，类器官的结构不受微孔的大小或形状的限制。Todhunter等(Todhunter等，2015)描述了通过DNA编程组装嵌入适当的位置的细胞阵列。首先通过将DNA寡核苷酸掺入其细胞膜中使细胞功能化，然后通过这些寡核苷酸与固定在玻璃上的DNA斑点内的互补序列的相互作用连接到载玻片上。多轮细胞粘附导致斑点周围形成3D微组织结构。在固定的细胞周围允许形成水凝胶，以便将它们嵌入适当的位置。US2011/0171712(Rivron等，2011)描述了在微阵列板的限制内细胞聚集体的生长。通过在微孔阵列顶部施加细胞悬浮液并使细胞沉淀至微阵列中以形成聚集体。当在孔中空间限制时，细胞自发聚集(第5栏，第4-5段)。聚集体的形状可以变化，并且可以例如形成球形、圆柱形、棒形或立方体(第2栏，第[0021]段)。然后从微孔中收集限制的聚集体，合并并转移至接种表面支架，以便组装为组织构建体(第4页，第[0037]段)，其中表面的形貌和模式可以控制该组装过程(第4页，第[0038]段)。然后诱导组织构建体经历形态发育，该过程可以由机械约束控制(第4页，第[0042]段)。特别地，生物材料可以用作提供机械支撑或有助于实现特定所需形状的支架(第5页，第[0048]段)。因此，Rivron的方法需要产生预先形成的组织聚集体，必须将所述组织聚集体收获并组合以产生组织。还描述了在微腔内上皮细胞的受限制的生长。Nelson等(Nelson等，2006)公开了从原代细胞或嵌入胶原凝胶的管状腔中的上皮细胞系的细胞产生工程化的上皮细胞管。当用生长因子(包括EGF和HGF)刺激时，管延伸分支到周围的胶原基质中。管状腔不用于从干细胞产生具有特定形状的类器官。此外，在目前的工作中，没有显示微腔的形状来模拟干细胞的命运，这是类器官发育的关键。WO2016/123474A1(在教堂山的北卡罗来纳大学)描述了使用几何结构作为支持物，并且通过可溶性因子的梯度进行干细胞模式化。此外，这项工作明确地提到多次，没有梯度时干细胞不会定位在微腔的底部，因此在所提出的系统中，形状不是类器官形态发育的驱动因素。因此，本领域需要一种在体外从干细胞或肿瘤细胞产生类器官的可靠方法，所述类器官准确地反映体内组织形态学。专利技术概要专利技术人提供了用于获得具有预先确定形状的类器官的方法，该方法包含将一个或更多个自我更新细胞接种到具有3D结构的表面上，在自我更新条件下培养所述接种的细胞，使得细胞增殖以形成具有与表面的特征相同的3D形状的集落，并在分化条件下培养集落，使得集落经历形态发育以形成类器官。专利技术人惊奇地发现，增殖的上皮细胞集落的几何结构为细胞提供了足够的信息，以指导本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于获得具有预先确定的组织形状和模式的类器官的方法，包括：i.接种一个或更多个自我更新细胞，所述自我更新细胞能够在具有3D结构的表面上分化以形成类器官，ii.在自我更新条件下培养所述接种的细胞，使得所述细胞增殖并模式化以形成具有与表面相同的3D结构的集落，和；iii.在分化条件下培养所述集落，使得所述集落经历通过初始几何结构在空间上模式化的细胞命运变化，以及随后的形态发育，以形成具有可再现和可预测的形态特征(例如，隐窝或芽)的类器官。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.18 EP 16199677.21.用于获得具有预先确定的组织形状和模式的类器官的方法，包括：i.接种一个或更多个自我更新细胞，所述自我更新细胞能够在具有3D结构的表面上分化以形成类器官，ii.在自我更新条件下培养所述接种的细胞，使得所述细胞增殖并模式化以形成具有与表面相同的3D结构的集落，和；iii.在分化条件下培养所述集落，使得所述集落经历通过初始几何结构在空间上模式化的细胞命运变化，以及随后的形态发育，以形成具有可再现和可预测的形态特征(例如，隐窝或芽)的类器官。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述自我更新细胞是干细胞或肿瘤细胞和/或所述自我更新细胞是胚胎干细胞、诱导多能干细胞、小肠干细胞、胃干细胞、结肠干细胞、胰腺干细胞、肝干细胞、肺干细胞、前列腺干细胞、乳腺干细胞、角膜干细胞、毛囊干细胞、表皮干细胞或肾干细胞或这些细胞的祖细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其中：i.在所述表面上制造所述3D结构，优选地其中所述3D结构包含微孔和/或微柱，所述3D结构具有相当于至少3层所述自我更新细胞的最小厚度，和/或所述3D结构具有相当于3D水凝胶基质的最大厚度。ii.所述3D结构包含所述表面内的腔，优选地其中a.所述腔是杆状、椭圆体或平行六面体，和/或b.所述腔形成管，其中所述管包含沿所述管的纵向轴线的纵向截面，其中所述截面具有矩形横截面，优选地，其中所述矩形具有长度在10μm至5mm之间的边，或者所述截面具有圆形或椭圆形横截面，优选地，其中所述椭圆形具有长度在10μm至5mm之间的两个主轴线，更优选地，其中一个主轴比另一个主轴长；和/或c.所述腔具有3D结构，包含：圆柱体，优选地，其中所述圆柱体具有10μm至5mm的直径，更优选地，其中所述圆柱体具有10μm至50mm之间的总长度，或者圆环，优选地，其中所述圆环具有在100μm和5mm之间的R值，更优选地，其中所述圆环具有在10μm和50mm之间的r值。4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中通过复制模塑、软压花、注塑、3D打印、生物打印、激光加工、显微机械加工、表面蚀刻、光刻、增材制造、电化学定向交联软蚀刻和/或聚二甲基硅氧烷(PDMS)复制模塑获得所述预先确定的3D结构。5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述表面是水凝胶，优选其中所述水凝胶包含：i.天然来源的组分，选自包含以下的组：多糖、凝胶状蛋白质、琼脂糖、藻酸盐、壳聚糖、葡聚糖、明胶、层粘连蛋白、胶原、透明质酸、纤维蛋白或其混合物，或者选自由基质胶、肌质胶和Cartigel组成的来源于复杂组织的基质的组，优选地其中在所述凝胶中，所述胶原的浓度为0.4mg/ml和约3.6mg/ml之间，并且基质胶处于90％(v/v)和10％(v/v)之间的百分比；或ii.用来源于细胞外基质(ECM)的蛋白质或肽功能化的交联的合成亲水聚合物，优选地其中所述亲水聚合物选自包含以下的组：聚(乙二醇)、聚噁唑啉、聚脂肪族聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚(环氧乙烷)、聚环氧丙烷、聚丙二醇、聚四氢呋喃、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟乙酯)、聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)及其混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：马提亚斯·卢托弗，尼科尔奇·纳雷斯奇，迈克·尼古拉耶夫，萨拉·热拉尔多，纳塔莉·布兰登贝格，田畑阳二，
申请(专利权)人：洛桑联邦理工学院，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH