一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，包括PCR反应液、PCR反应酶系、定量标准品、阳性质控品以及阴性质控品，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、EB病毒和巨细胞病毒特异性的正、反向引物、EB病毒和巨细胞病毒特异性荧光探针；本发明专利技术应用实时荧光定量PCR技术，采用多重PCR引物和2种特异性荧光探针，通过双标准曲线法可以实现一个反应中同时对样本中的EB病毒和巨细胞病毒载量进行定值，可实现1管双重的定量检测，可广泛应用于EB病毒和巨细胞病毒相关疾病临床早期诊断、药物疗效、愈后监测及科学研究等多个领域，具有检测半自动化、检测速度快、灵敏高、适用样本范围广的特点。

A Kit for Multiple Quantitative Detection of Epstein-Barr Virus and Cytomegalovirus

【技术实现步骤摘要】
一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒
本专利技术涉及基因检测领域，具体来说是涉及一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒。
技术介绍
EB病毒(EBV)和人巨细胞病毒(CMV)均属于人类疱疹病毒，在我国的感染率较高，是最常见病毒感染。多数人在幼年或青年时期获得感染，人巨细胞病毒原发感染和复发感染可以引起呼吸、神经、血液和消化系统等多系统疾病，严重者可危及患者生命，对人们的身体健康造成严重损害。EB病毒与传染性单核细胞增多症、鼻咽癌、淋巴瘤等疾病密切相关。人巨细胞病毒感染可累及消化道、中枢神经系统和肺等多种器官,在血液肿瘤移植患者中，巨细胞病毒的感染率高达32％～45％，病死率可达75％～90％。准确、快速、定量诊断EBV和CMV感染的方法在早期诊断和治疗中起到日益重要的作用。目前检测EB病毒和人巨细胞病毒的金标准是病毒培养。针对不同病毒，采用的细胞略有不同，被病毒感染的细胞，在形态上会出现变化，出现细胞病变效应。病毒的细胞培养通常在发病后采集患者临床样本进行检测，操作繁琐，耗时长，对病情的及时诊断和疾病暴发的控制不利，较低载量的病毒及隐性感染均会导致漏检。传统的血清学检测虽然简便快速，但是敏感性较差，且不能对病毒的载量进行检测，应用实时荧光定量PCR技术检测样本中的EBVDNA和CMVDNA，比常规PCR技术灵敏度更高，且可以同时对2种病毒的载量进行定值，能够更为精确地反映患者EBV和CMV感染的状态。国内外常见的EB病毒或巨细胞病毒检测试剂盒均为单一病毒检测，无法同时对EB病毒和巨细胞病毒进行定量，国内也有比较多的单个病毒定量或定性检测的专利技术专利，如专利技术专利CN201810631220.2、CN201710427671.X、CN201810979964.3，这些专利均为单独检测无法同时对EBV和CMV进行检测。国内专利技术专利CN201610567706.5虽然可以同时对巨细胞病毒和EB病毒进行检测，但是无法对两种病毒进行定量，只可进行定性检测无法进行病毒载量的定值。本专利技术基于国内无同时对EBV和CMV定量检测的情况，同时结合临床检测的意义，开发了一种双重荧光定量检测试剂，可同时对EB病毒和巨细胞病毒进行定性和定量的检测，对患者血浆中EBVDNA和CMVDNA的水平变化进行检测，以监测病毒水平的动态变化与患者病毒感染的预防、诊断与治疗的关系。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的主要目的在于提供一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、PCR反应酶系、定量标准品、阳性质控品以及阴性质控品，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、EB病毒和巨细胞病毒特异性的正、反向引物、EB病毒和巨细胞病毒特异性荧光探针，其中，所述EB病毒特异性正向引物的核苷酸序列为：5’GTTTGAAGGATGCGATTAAGGAC-3’，所述EB病毒特异性反向引物的核苷酸序列为：5’GGCAAATCTACTCCATCGTCAA-3’；所述巨细胞病毒特异性正向引物的核苷酸序列为：5’ACGGGCGGTTTAATAATCACC-3’，所述巨细胞病毒特异性反向引物的核苷酸序列为：5’GTCGCGGTTACTAACACTCCT-3’；所述EB病毒特异性荧光探针的核苷酸序列为：5’ATGCCAAAGCCCGCTCCTACCTG-3’；所述巨细胞病毒特异性荧光探针的核苷酸序列为：5’CTACTCCCGAGCTCAGCCCGCGTA-3’。作为优选的技术方案，所述定量标准品由定量参考品1、定量参考品2、定量参考品3、定量参考品4和定量参考品5组成，其浓度分别2ⅹ107copies/mL、2ⅹ106copies/mL、2ⅹ105copies/mL、2ⅹ104copies/mL、2ⅹ103copies/mL。作为优选的技术方案，所述定量参考品1、定量参考品2、定量参考品3、定量参考品4和定量参考品5均由含EB病毒和巨细胞病毒序列的DNA组成，其序列为：TCACGATACAGCCGGCGGTATCGATAATCTTGTTGCGGTACTGGATGGTAAAGTCGGGCTCGGGCTTGATGTCTTCCTGTTTGATGAGGGGCAGCATGATAGGCGCGGGAGGCACGGGCGGTTTAATAATCACCTTGAAAGGACGCGTGGTTTTGCGCGGTTTCTTACGCGGGCTGAGCTCGGGAGTAGCGGATGCCCCGGGGAGAGGAGTGTTAGTAACCGCGACGCTGGTGGGGGTCGGCTTGTTAAGAGGGGCGCTGCTAACGCTGCAAGAGTGGGTTGTCAGCGTGGGGCCGGTGCTACTGGAATCGATACCGGCATGATTGACAGCCTGGGCGAGGATGTCACCTGATGGTGATAAGAAGACACGGGAGACTTAGTACGGTTTCACAGGCGTGACACGTTTATTGAGTAGGATTACAGAGTATAACATAGAGTATAATATAGAGTATACAATAGTGACGTGGGATCCATAACAGTAACTGATATATATATTTTTACAAACTCATATATTTGCTGAGGGTTTGAAGGATGCGATTAAGGACCTTGTTATGCCAAAGCCCGCTCCTACCTGCAATATCAAGGCGACTGTGTGCAGCTTTGACGATGGAGTAGATTTGCCTCCCTGGTTTCCACCTATGGTGGAAGGGGCTGCCGCGGAGGGTGATGACGGAGATGACGGAGATGACGGAGATGAAGG。作为优选的技术方案，所述PCR缓冲液由50mmol/LTris-HCl、3～8mmol/LMgCl2和150～350mmol/LKCl组成。进一步，PCR缓冲液中Tris-HCl的pH值为8.2。作为优选的技术方案，所述PCR反应酶系由UDG酶、热启动Taq酶、dUTPs组成，每人份PCR反应酶系中UDG酶的用量为1～3U，最佳用量2U；热启动Taq酶的用量为2～5U，最佳用量3U；dNTPs为6～12mmol，最佳用量10mmol。进一步，PCR扩增的条件为：50℃2分钟，95℃10分钟；95℃10秒，58℃35秒，45个循环(58℃时收集荧光信号)。作为优选的技术方案，所述EB病毒特异性荧光探针的5’标记有VIC荧光基团，3’标记有淬灭基团BHQ1。作为优选的技术方案，所述巨细胞病毒特异性荧光探针的5’标记有FAM荧光基团，3’标记有淬灭基团BHQ1。作为优选的技术方案，所述EB病毒正、反向引物的扩增体系终浓度均为0.15μmol/L，所述巨细胞病毒特异性正、反向引物的扩增体系终浓度均为0.08μmol/L，所述EB病毒特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.08μmol/L，所述巨细胞病毒特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.04μmol/L。作为优选的技术方案，所述阴性质控品为生理盐水。作为优选的技术方案，所述阳性质控品为基因合成方式制备的含EB病毒和巨细胞病毒的全长DNA，且浓度在1ⅹ104copie本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、PCR反应酶系、定量标准品、阳性质控品以及阴性质控品，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、EB病毒和巨细胞病毒特异性的正、反向引物、EB病毒和巨细胞病毒特异性荧光探针，其中，所述EB病毒特异性正向引物的核苷酸序列为：5’GTTTGAAGGATGCGATTAAGGAC‑3’，所述EB病毒特异性反向引物的核苷酸序列为：5’GGCAAATCTACTCCATCGTCAA‑3’；所述巨细胞病毒特异性正向引物的核苷酸序列为：5’ACGGGCGGTTTAATAATCACC‑3’，所述巨细胞病毒特异性反向引物的核苷酸序列为：5’GTCGCGGTTACTAACACTCCT‑3’；所述EB病毒特异性荧光探针的核苷酸序列为：5’ATGCCAAAGCCCGCTCCTACCTG‑3’；所述巨细胞病毒特异性荧光探针的核苷酸序列为：5’CTACTCCCGAGCTCAGCCCGCGTA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、PCR反应酶系、定量标准品、阳性质控品以及阴性质控品，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、EB病毒和巨细胞病毒特异性的正、反向引物、EB病毒和巨细胞病毒特异性荧光探针，其中，所述EB病毒特异性正向引物的核苷酸序列为：5’GTTTGAAGGATGCGATTAAGGAC-3’，所述EB病毒特异性反向引物的核苷酸序列为：5’GGCAAATCTACTCCATCGTCAA-3’；所述巨细胞病毒特异性正向引物的核苷酸序列为：5’ACGGGCGGTTTAATAATCACC-3’，所述巨细胞病毒特异性反向引物的核苷酸序列为：5’GTCGCGGTTACTAACACTCCT-3’；所述EB病毒特异性荧光探针的核苷酸序列为：5’ATGCCAAAGCCCGCTCCTACCTG-3’；所述巨细胞病毒特异性荧光探针的核苷酸序列为：5’CTACTCCCGAGCTCAGCCCGCGTA-3’。2.根据权利要求1所述的一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述定量标准品由定量参考品1、定量参考品2、定量参考品3、定量参考品4和定量参考品5组成，其浓度分别为2ⅹ107copies/mL、2ⅹ106copies/mL、2ⅹ105copies/mL、2ⅹ104copies/mL、2ⅹ103copies/mL。3.根据权利要求2所述的一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述定量参考品1、定量参考品2、定量参考品3、定量参考品4和定量参考品5均由含EB病毒和巨细胞病毒序列的DNA组成，其序列为：TCACGATACAGCCGGCGGTATCGATAATCTTGTTGCGGTACTGGATGGTAAAGTCGGGCTCGGGCTTGATGTCTTCCTGTTTGATGAGGGGCAGCATGATAGGCGCGGGAGGCACGGGCGGTTTAATAATCACCTTGAAAGGACGCGTGGTTTTGCGCGGTTTCTTACGCGGGCTGAGCTCGGGAGTAGCGGATGCCCCGGGGAGAGGAGTGTTAGTAACCGCGACGCTGGTGGGGGTCGGCTTGTTAAGAGGGGCGCTGCTAACGCTGCAAGAGTGGGTTGTCAGCGTGGGGCCGGTGCTACTGGAATCGATACCGGCATGATTGACAGCCTGGGCGAGGATGTCACCTGATGGTGATAAGAAGACACGGGAGACTTAGTA...

【专利技术属性】
技术研发人员：周其伟，孙伟，陈健，方军，王宪国，吴永，
申请(专利权)人：江苏达伯药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32