MIF抑制剂及其使用方法技术

本文提供了治疗由增强的聚[ADP‑核糖]聚合酶1(PARP‑1)活化导致的疾病例如帕金森病的方法，所述方法通过抑制巨噬细胞移动抑制因子(MIF)核酸酶活性来治疗所述疾病。

MIF inhibitors and their use

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】MIF抑制剂及其使用方法相关申请本申请根据35U.S.C.§119(e)要求属于2016年9月2日提交的美国临时申请第62/383,209号的权益，其在此被通过引用以其整体并入本文。拨款信息：本专利技术是在国立卫生研究院拨款K99/R00NS078049，DA000266，R01NS067525，R37NS067525和NS38377的政府支持下完成的。政府在本专利技术中拥有某些权利。专利技术背景专利
本专利技术整体上涉及巨噬细胞移动抑制因子(MIF)，并且更具体地涉及MIF抑制剂在治疗疾病中的用途。背景聚(ADP-核糖)(PAR)聚合酶-1(PARP-1)是被DNA损伤激活的重要的细胞核酶，其在DNA损伤处促进DNA修复(1)。PARP-1的过度活化会导致被称为依赖性细胞死亡(parthanatos)的不依赖胱天蛋白酶(caspase)的固有细胞死亡程序(2,3)，该程序在许多器官系统受到大量毒性损伤后发挥突出的作用(4,5)，所述毒性损伤包括中风和心肌梗死后的缺血再灌注损伤、炎性损伤、活性氧物质诱导的损伤、谷氨酸兴奋毒性和神经退行性疾病例如帕金森病和阿尔茨海默病(2，4，6)。与PARP-1是关键的细胞死亡介导因子的观点一致，PARP抑制剂或PARP-1的基因缺失针对这些和其他细胞损伤范例和人类疾病模型有着意义深远的保护作用(2，4，5，7)。奠定依赖性细胞死亡的分子机制涉及PAR-依赖性凋亡诱导因子(AIF)从线粒体释放并转位到细胞核，导致DNA片段化为20-50kb的片段(2，8-11)。AIF本身没有明显的核酸酶活性(2)。虽然已经有研究表明CED-3蛋白酶抑制剂(CPS)-6，一种秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans(C.elegans))中的核酸内切酶G(EndoG)同源物，与蠕虫AIF同源物(WAH-1)协作促进DNA降解(12)，但是EndoG似乎在哺乳动物中的短暂局灶性脑缺血后的PARP-依赖性染色质溶解和细胞死亡中不发挥重要作用(13)。在依赖性细胞死亡过程中负责染色质溶解的核酸酶尚不被知晓。专利技术概述本专利技术基于将巨噬细胞移动抑制因子(MIF)鉴定为PARP-1依赖性的AIF-相关核酸酶(PAAN)。在一个实施方案中，本专利技术提供了治疗受试者中的与增强的聚[ADP-核糖]聚合酶1(PARP-1)活化相关的疾病的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的核酸酶活性抑制剂，从而治疗或减轻该疾病的症状。在一个方面，疾病是炎症性疾病。另一方面，炎症性疾病是阿尔茨海默病、强直性脊柱炎、关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、哮喘动脉粥样硬化、克罗恩病、结肠炎、皮炎憩室炎、纤维肌痛、肝炎、肠易激综合征、系统性红斑狼疮、肾炎、溃疡性结肠炎或帕金森病。在一个实施方案中，该抑制剂是例如来自混合(hybrid)大环rapafucin文库的大环rapafucin化合物。本专利技术还提供了筛选巨噬细胞移动抑制因子(MIF)抑制剂的方法，包括例如以下的步骤：固定单链的胺修饰的MIF靶DNA，随后在有和没有来自大环rapafucin文库的化合物的情况下孵育MIF；将单链的胺修饰的MIF靶DNA与生物素化的DNA杂交，该生物素化的DNA与单链的胺修饰的MIF靶DNA互补，接下来与链霉亲和素酶缀合物一起孵育，接下来与底物孵育，其中该链霉亲和素酶缀合物作用于该底物。将在有文库化合物情况下的MIF的吸光度和没有文库化合物情况下的MIF的吸光度进行比较，以便基于吸光度的变化来确定化合物是否为抑制剂。附图简述图1.MIF作为介导PARP-1依赖性细胞死亡的关键性细胞死亡效应因子的鉴定。(A)鉴定参与PARP-1依赖性细胞死亡的AIF-相关蛋白的策略。(B)在MNNG处理(50μM，15分钟)后24小时，Hela细胞中的基于siRNA的PARP-1依赖性细胞活力高通量筛选。n＝8。实验在4次独立测试中重复。(C)MIF的PD-D/E(X)K结构域的示意图。(D)人MIF和其他核酸酶的核酸酶结构域的比对。序列上方的箭头指示β-链，且矩形表示α-螺旋。突变的氨基酸残基用箭头和数字指示(参见结果)。核酸酶和CxxCxxHx(n)C结构域分别以绿色和粉红色突出显示。(E)MIF三聚体(pdb:1GD0)(左)和三聚体形式的MIFPD-D/E(x)K基序(右)的晶体结构。图2.MIF是切割基因组DNA的新型核酸酶。(A)使用pcDNA为底物的体外MIF核酸酶测定。(B)在含有Mg2+(10mM)、含有或不含有EDTA(50mM)或含有Ca2+(2mM)、含有或不含有EDTA(25mM)的缓冲液中的体外脉冲场凝胶电泳-MIF核酸酶测定，使用人类基因组DNA作为底物。(C)对于用或未用DPQ(30μM)或ISO-1(100μM)处理的MIF缺陷的HeLa细胞和野生型HeLa细胞中的MNNG诱导的DNA损伤的脉冲场凝胶电泳测定。(D)使用人类基因组DNA作为底物，对MIFWT和MIF突变体的核酸酶测定。图3.MIF结合并切割单链DNA。(A)由ChIP-seq确定的MIFDNA结合基序。(B)MIF具有结构特异性地与ssDNA结合，但不与双链DNA结合。5’生物素标记的具有不同结构或不同序列的小DNA底物被用在EMSA测定中(对底物的说明参见图19，而序列参见表1)。(C)MIF具有结构特异性地切割在茎环ssDNA的3’端的未配对碱基。5’或3’生物素标记的具有不同结构或不同序列的小DNA底物被用于核酸酶测定(对底物的说明参见图19，而序列参见表1)。使用纯化自3次独立制备的MIF蛋白重复实验4次。(D)MIF从未标记的PS30和3F1底物上切割掉3’未配对的碱基。梯形物1和2是使用PS30及其切割产物，通过一个接一个地去除其3’核苷酸而定制的。梯形物1使用PS30、PS28、PS26、PS24、PS22和PS20制备。梯形物2使用PS29、PS27、PS25、PS23和PS21制备。(E)未标记的PS30和3F1底物上的MIF切割位点。图4.在NMDA处理后，需要AIF来招募MIF进入细胞核。(A)结合AIF的固定的GST-MIFWT和GST-MIF变体的GST拉下(GST-pulldown)测定。(B)MIFWT和MIF变体的核酸酶活性和AIF结合活性。(C-D)在生理条件和NMDA处理的条件下，MIF和AIF在皮层神经元中的免疫共沉淀。星形指示IgG。(E-G)在NMDA处理后，野生型、AIF敲除型和MIF敲除型皮层神经元的AIF和MIF核转位。核后(postnuclear)部分(PN)和核部分(N)中AIF和MIF信号的强度在G中示出。(H)MIF在WT和KO神经元中的表达。(I)在NMDA处理后，皮层神经元中Flag标记的MIF变体和AIF的免疫共沉淀。(J-L)，在NMDA处理后，AIF和外源性MIFWT和MIF变体在MIFKO皮层神经元中的核转位。比例尺，20μm。在核后部分(PN)和核部分(N)中AIF和MIF信号的强度在L中示出。示出了平均值±SEM。实验重复至少3次。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，学生t检验(Student本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗受试者中以增强的聚[ADP‑核糖]聚合酶1(PARP‑1)活化为特征的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的核酸酶活性的抑制剂，从而治疗所述疾病。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.02 US 62/383,2091.一种治疗受试者中以增强的聚[ADP-核糖]聚合酶1(PARP-1)活化为特征的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的核酸酶活性的抑制剂，从而治疗所述疾病。2.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病是炎症性疾病。3.如权利要求2所述的方法，其中所述炎症性疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、强直性脊柱炎、关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、哮喘动脉粥样硬化、克罗恩病、结肠炎、皮炎憩室炎、纤维肌痛、肝炎、肠易激综合征、系统性红斑狼疮、肾炎、溃疡性结肠炎和帕金森病。4.如权利要求3所述的方法，其中所述疾病是帕金森病。5.如权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂选自大环r...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·M·道森，V·L·道森，王莹飞，朴惠真，J·刘，彭翰菁，金泰仁，
申请(专利权)人：约翰霍普金斯大学，
类型：发明
国别省市：美国,US