一种饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法，所述方法是应用特异性引物及荧光探针对两歧双歧杆菌的分子特征进行识别，所述引物及荧光探针序列为：上游引物：5’‑CCACATGATCGCATGTGATTG‑3’；下游引物：5’‑CCGAAGGCTTGCTCCCAAA‑3’；荧光探针：5’‑CCTCCATCCCTCACGC‑3’；所述荧光探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。本发明专利技术方法能够快速、准确地鉴定两歧双歧杆菌。

Identification of Bifidobacterium bifidum in feed

【技术实现步骤摘要】
一种饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法
本专利技术涉及一种饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法。
技术介绍
双歧杆菌（Bifidobacterium）是重要的维持肠道菌群平衡的益生菌，因其具有促进维生素代谢、缓解乳糖不耐症、降低血清胆固醇、抗癌抗氧化、延缓衰老、缓解便秘等诸多益生作用而被广泛关注。人类根据该菌能在肠道定檀繁殖的特点，通过向饲料中添加双歧杆菌活菌制剂而使其在动物肠道内自然增殖的方法，人为地建立优势菌用于动物疾病治疗，且取得了很好的效果，国内有关于过活菌制剂治疗动物腹泻、白痢等病的相关报导。我国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录》中也规定两歧双歧杆菌(Bifidobactiriumbifidum)可以直接用于动物饲喂。双歧杆菌制剂与之前长时间且大范围使用的抗生素相比，有许多优越之处，如安全可控、菌株同源、无污染、不会产生耐药菌株、无残留、提高生长性能，因此双歧杆菌制剂逐渐代替抗生素而得到饲料行业和养殖户的认可。并被广泛应用于动物饲料等多种益生菌产品中。研究表明，当双歧杆菌含量在106CFU/mL(g)以上时，才能在宿主肠道内发挥其生理功效。饲料中双歧杆菌活菌数量及菌株类别是判断其质量好坏和保健功能的重要指标。但由于双歧杆菌饲料的资金需求低、利润高、接受度广，因而吸引了众多的大小型饲料企业的参与，其中难免鱼龙混杂，饲料产品的品质难以保证。因此准确、快速的对双歧杆菌进行鉴定则尤为重要，但是目前国内没有饲料中双歧杆菌的检测和鉴定标准，亟需开发相关标准方法以补充空白与不足。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种方法，应用于饲料中两歧双歧杆菌的鉴定，为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：所述的饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法，其特征在于，所述的方法是应用特异性引物及荧光探针对两歧双歧杆菌的分子特征进行识别，所述引物及荧光探针的序列为：上游引物：5’-CCACATGATCGCATGTGATTG-3’；下游引物：5’-CCGAAGGCTTGCTCCCAAA-3’；荧光探针：5’-CCTCCATCCCTCACGC-3’；荧光探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。所述的饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法，实时荧光PCR反应体系总体积为25μL，其中2×TaqManPCRMasterMix：12.5μL，上游引物：0.5μL，下游引物：0.5μL，荧光探针：0.5μL，浓度为10ng/μL的DNA模板：1μL，无菌去离子水：10μL。所述的饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法，所述实时荧光PCR反应的程序为：95℃预变性5min；95℃、30s，71℃、60s，45个循环；在每个循环的71℃退火并延伸阶段收集荧光信号。所述的饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法，所述实时荧光PCR反应结束后根据扩增曲线判定结果，判定方法如下：在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线条件下，若待测DNA模板出现典型扩增曲线，且Ct值小于或等于36时，判定为两歧双歧杆菌；若Ct值大于或等于40时，判定为非两歧双歧杆菌；若Ct值大于36且小于40时，应重新进行测试；重新测试的Ct值大于或等于40时，判定为非两歧双歧杆菌，重新测试的Ct值小于40时，则判定为两歧双歧杆菌。在本专利技术中，DNA浓度及纯度通过Ultrospec2100pro核酸蛋白测定仪检测。而荧光探针标记的发光基团和猝灭基团可根据所采用的实时荧光PCR仪的配置而定，例如探针5’端可以用FAM标记，而3’端可以用TAMRA标记。与现有技术比较，本专利技术的有益效果是：本专利技术方法能够快速、准确地鉴定两歧双歧杆菌，可以为饲料中两歧双歧杆菌的鉴定提供了新的技术手段，以补充国内相关技术的空白与不足，为饲料检测提供技术保障。附图说明图1：两歧双歧杆菌标准菌株（CICC6071）鉴定的扩增曲线其中，曲线1~3为两歧双歧杆菌（CICC6071）的三个平行扩增曲线；曲线4~21为阴性对照的扩增曲线，阴性对照为动物双歧杆菌（CICC6165）、长双歧杆菌（CICC6068）、婴儿双歧杆菌（CICC6069）、青春双歧杆菌（CICC6070）、短双歧杆菌（CICC6079）、植物乳杆菌（ATCC8014）共计6种菌的DNA模板，每种菌设三个平行；曲线22~24为空白对照的三个平行的扩增曲线。图2：饲料样品中两歧双歧杆菌的鉴定的扩增曲线其中，曲线1~3为阳性对照两歧双歧杆菌（CICC6071）的三个平行的扩增曲线；曲线4~6为样品A的DNA模板三个平行的扩增曲线；曲线6~9为样品B的DNA模板三个平行的扩增曲线；曲线10~12为样品C的DNA模板三个平行的扩增曲线；曲线13~30为阴性对照的扩增曲线，阴性对照为动物双歧杆菌（CICC6165）、长双歧杆菌（CICC6068）、婴儿双歧杆菌（CICC6069）、青春双歧杆菌（CICC6070）、短双歧杆菌（CICC6079）、植物乳杆菌（ATCC8014）共计6种菌的DNA模板，每种菌设三个平行；曲线31~33为DNA提取的空白对照CK1三个平行的扩增曲线；曲线34~36为PCR空白对照CK2三个平行的扩增曲线。具体实施方式以下结合实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明，应当理解，所描述的实施例仅仅用以解释本专利技术，不用于限定本专利技术。凡是基于本专利技术的技术方案所作的简化或者等同变化，均属于本专利技术的保护范围。（注：本专利技术中CICC6071等为中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)菌种保藏编号，ATCC8014等为美国模式培养物集存库编号）。实施例一：两歧双歧杆菌标准菌株（CICC6071）的鉴定一种饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法，采用以下技术方案以达到本专利技术实施例一的有益效果：1、DNA模板的准备购买7种菌的标准菌株，菌株名称和编号分别为：动物双歧杆菌（CICC6165）、长双歧杆菌（CICC6068）、婴儿双歧杆菌（CICC6069）、青春双歧杆菌（CICC6070）、两歧双歧杆菌（CICC6071）、短双歧杆菌（CICC6079）、植物乳杆菌（ATCC8014）。所述的标准菌株分别经过活化复苏后，获得纯培养物。纯培养物用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒，按使用说明书操作提取DNA。用核酸蛋白测定仪测定DNA的浓度，用TE溶液将DNA稀释至10ng/μL，得到DNA模板，置于-20℃保存备用。2、实时荧光PCR方法的建立所述的引物和探针委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，上游引物序列为：5’-CCACATGATCGCATGTGATTG-3’；下游引物序列为：5’-CCGAAGGCTTGCTCCCAAA-3’；荧光探针序列为：5’-CCTCCATCCCTCACGC-3’；所述荧光探针的5’端用FAM标记，3’端用TAMRA标记。实时荧光PCR反应体系总体积为25μL，其中2×TaqManPCRMasterMix：12.5μL，上游引物：0.5μL，下游引物：0.5μL，荧光探针：0.5μL，浓度为10ng/μL的DNA模板：1μL，无菌去离子水：10μL。实时荧光PCR反应体的DNA模板分别选用两歧双歧杆菌（CICC6071）为阳性对照；以动物双歧杆菌（CICC6165）、长双歧杆菌（CICC6068）、婴儿双歧杆菌（CICC6069）、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法，其特征在于， 所述的方法是应用特异性引物及荧光探针对两歧双歧杆菌的分子特征进行识别，所述引物及荧光探针的序列为：上游引物：5’‑CCACATGATCGCATGTGATTG‑3’；下游引物：5’‑CCGAAGGCTTGCTCCCAAA‑3’；荧光探针：5’‑CCTCCATCCCTCACGC‑3’；所述荧光探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团;实时荧光PCR反应体系总体积为25 μL，其中2×TaqMan PCR Master Mix：12.5 μL，上游引物：0.5 μL，下游引物：0.5 μL，荧光探针：0.5 μL，浓度为10 ng/μL的DNA模板：1 μL，无菌去离子水：10 μL;实时荧光PCR反应的程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃、30 s，71 ℃、60 s，45个循环；在每个循环的71 ℃退火并延伸阶段收集荧光信号;所述实时荧光PCR反应结束后根据扩增曲线判定结果，判定方法如下：在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线条件下，若待测DNA模板出现典型扩增曲线，且Ct值小于或等于36时，判定为两歧双歧杆菌；若Ct值大于或等于40时，判定为非两歧双歧杆菌；若Ct值大于36且小于40时，应重新进行测试；重新测试的Ct值大于或等于40时，判定为非两歧双歧杆菌，重新测试的Ct值小于40时，则判定为两歧双歧杆菌。...

【技术特征摘要】
1.一种饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法，其特征在于，所述的方法是应用特异性引物及荧光探针对两歧双歧杆菌的分子特征进行识别，所述引物及荧光探针的序列为：上游引物：5’-CCACATGATCGCATGTGATTG-3’；下游引物：5’-CCGAAGGCTTGCTCCCAAA-3’；荧光探针：5’-CCTCCATCCCTCACGC-3’；所述荧光探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团;实时荧光PCR反应体系总体积为25μL，其中2×TaqManPCRMasterMix：12.5μL，上游引物：0.5μL，下游引物：0.5μL，荧光探针：0.5μL，浓度为10ng/μL的DNA模板：1μL，无菌去离子水：10μL;实时荧光PCR反应的程序为：95℃预变性5min；95℃、30s，71℃、60s，45个循环；在每个循环的71℃退火并延伸阶段收集荧光信号;所述实时荧光PCR反应结束后根据扩增曲线判定结果，判定方法如下：在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线条件下，若待测DNA模板出现典型扩增曲线，且Ct值小于或等于36时，判定为两歧双歧杆菌；若Ct值大于或等于40时，判定为非两歧双歧杆菌；若Ct值大于36且小于40时，应重新进行测试；重新测试的Ct值大于或等于40时，判定为非两歧双歧杆菌，重新测试的Ct值小于40时，则判定为两歧双歧杆菌。2.一种饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法，其特征在于，所述的的鉴定方法包括如下步骤:(1)DNA模板的准备购买7种菌的标准菌株，菌株名称和编号分别为：动物双歧杆菌（CICC6165）、长双歧杆菌（CICC6068）、婴儿双歧杆菌（CICC6069）、青春双歧杆菌（CICC6070）、两歧双歧杆菌（CICC6071）、短双歧杆菌（CICC6079）、植物乳杆菌（ATCC8014）。所述的标准菌株分别经过活化复苏后，获得纯培养物。纯培养物用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒，按使用说明书操作提取DNA。用核酸蛋白测定仪测定DNA的浓度，用TE溶液将DNA稀释至10ng/μL，得到DNA模板，置于-20℃保存备用;(2)实时荧光PCR方法的建立所述的引物和探针委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，上游引物序列为：5’-CCACATGATCGCATGTGATTG-3’；下游引物序列为：5’-CCGAAGGCTTGCTCCCAAA-3’；荧光探针序列为：5’-CCTCCATCCCTCACGC-3’；所述荧光探针的5’端用FAM标记，3’端用TAMRA标记;实时荧光PCR反应体系总体积为25μL，其中2×TaqManPCRMasterMix：12.5μL，上游引物：0.5μL，下游引物：0.5μL，荧光探针：0.5μL，浓度为10ng/μL的DNA模板：1μL，无菌去离子水：10μL;实时荧光PCR反应体的DNA模板分别选用两歧双歧杆菌（CICC6071）为阳性对照；以动物双歧杆菌（CICC6165）、长双歧杆菌（CICC6068）、婴儿双歧杆菌（CICC6069）、青春双歧杆菌（CICC6070）、短双歧杆菌（CICC6079）、植物乳杆菌（ATCC8014）共计6种菌的DNA模板为阴性对照；另设置PCR空白对照；每种模板设置三个平行;实时荧光PCR反应的程序为：95℃预变性5min；95℃、30s，71℃、60s，45个循环；在每个循环的71℃退火并延伸阶段收集荧光信号;结果判定方法如下：在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线的条件下，若待测DNA模板出现典型...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩涛，高宇，傅德江，张雅薇，林碧莲，张芳，李颖，
申请(专利权)人：福建省产品质量检验研究院，
类型：发明
国别省市：福建,35