一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法及其试剂盒技术

一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法及其试剂盒。该方法包括利用免疫磁珠富集金黄色葡萄球菌，对富集的金黄色葡萄球菌进行DNA提取，对提取的金黄色葡萄球菌的DNA进行LAMP检测等步骤。本发明专利技术的方案，使用链霉亲和素‑生物素介导偶联的免疫磁珠，制备时间为1h，大大降低了制备免疫磁珠的时间。同时链霉亲和素与生物素间有极高的亲和力，故本发明专利技术的免疫磁珠能够与抗体和磁珠直接偶联制备的免疫磁珠相比，本发明专利技术的磁珠表面能够结合更多抗体，从而大大提高了捕获率。

A Rapid Method for Detecting Staphylococcus aureus in Food and Its Kit

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法及其试剂盒
本专利技术属于食品微生物检测
，涉及一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法及其试剂盒。
技术介绍
金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病菌，常存在于奶、肉、蛋、鱼、虾等食品中，其产生的肠毒素可引起食物中毒，导致皮肤和软组织感染、败血症、骨髓炎和肺炎等疾病。目前我国用于检测食品中食源性致病菌的传统方法多为选择性培养基、显微镜镜检和生化培养鉴定等，其优点是操作简便，所需设备简单，但耗时长、灵敏性差，无法快速检测，会对经济生产活动产生一定的影响。随着免疫学和分子生物学在食品安全方面的应用，致病菌的检测效率正在逐步提升，目前常采用的方法有聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)、基因芯片法、酶联免疫吸附测定技术(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELASA)、生物传感器等，但这些方法仍需要昂贵的试剂与实验设备，无法满足突发公共卫生事件时对食源性致病菌快速、准确、便携的现场检测需求。免疫磁珠分离技术(immunomagneticseparation，IMS)就是目前运用广泛的一种快速有效的前处理方法,能够缩短微生物检测的增菌时间,实现微生物致病菌的快速检测。1979年,Ugelstad等人首次制成了分离细胞效果极佳的免疫磁珠，因其操作简便、特异性强、可有效保持目标物原有的特性,被广泛应用于分子生物学领域。该技术利用具有磁性的微颗粒结合特定抗体，在液相中能特异性地与相应的抗原结合，依靠磁场的作用力快速地与样品稀释液分离，从而达到富集、纯化样品的目的。2000年，Notomi等人提出了一种新型核酸扩增技术，环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)，该技术利用4～6条的特异性引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNA聚合酶)，在等温条件(60～65℃)下可高效、快速、特异性地扩增靶序列。该技术避免了核酸扩增对温度和昂贵仪器的要求，并且该技术特异性强、灵敏度高、实验步骤简单、不需要专业的技术人员，适合现场快速检测食源性致病菌。本专利技术建立了一种免疫磁珠-环介导等温扩增法(IMS-LAMP)对金黄色葡萄球菌进行快速、准确的检测，该方法避免使用价格高昂的仪器，降低了实验成本。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术所解决的技术问题在于提供一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法及。本专利技术所解决的技术问题还在于提供一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一方面，本专利技术公开了一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：1)利用免疫磁珠富集金黄色葡萄球菌:取1mL待测样品于1.5mL离心管中,投入免疫磁珠300μL混匀；垂直混匀仪上室温孵育30min后，将其置于磁力架上3min使磁珠充分吸附后，将上清液弃去，取下磁力架上的离心管，加入1mL的0.01mol/LPBS洗涤悬浮，充分混匀，然后置于磁力架上3min，使磁珠充分吸附后，弃去悬浮液，重复洗涤3次，加入1mL0.01mol/LPBS震荡重悬磁珠，将富集得到的磁珠-菌体复合物用于后续的DNA提取及环介导等温扩增法(LAMP)的检测；2)对富集的金黄色葡萄球菌进行DNA提取:采用市售的DNA提取试剂盒提取磁珠-菌体复合物的DNA，其原理是基于硅胶柱纯化方式，利用试剂盒中的溶菌酶(Lysozyme)消化去除金黄色葡萄球菌的细胞壁，在裂解液和蛋白酶(ProteinaseK)作用下裂解消化，DNA释放到裂解液中；加入乙醇后，转移至吸附柱(Column)中过滤，DNA被吸附至吸附柱的膜上，而蛋白质则被去除；吸附柱经洗涤后去除其他杂质，最后通过低盐缓冲液洗脱DNA，洗脱的DNA可直接用于后续的LAMP的检测；3)对提取的金黄色葡萄球菌的DNA进行LAMP检测:使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃15s，63℃45s作为一个循环，于63℃45s处收集荧光信号，30个循环；反应完成后，根据机器绘制的扩增曲线判断扩增结果，若出现“S”形曲线则为阳性扩增，而获得线性或稍微倾斜的扩增曲线则为阴性扩增。优选地，步骤1)中所用免疫磁珠的制备方法为：颠倒混匀PBS溶液中的500nm链霉亲和素磁珠，吸取50μl的链霉亲和素磁珠加入1.5ml灭菌离心管中；然后加1ml0.01mol/LPBST缓冲液，洗涤磁珠，磁场吸附，弃上清液；将磁珠重悬于1ml0.01mol/LPBST缓冲液，加入20μl含生物素标记的金黄色葡萄球菌的多克隆抗体，垂直混匀仪上轻柔振荡，在室温下孵育45分钟；在磁场吸附，弃去上清液；后加入0.01mol/LPBST缓冲液(每次1ml)洗涤磁珠3次，每次5min，磁场吸附，弃去上清液；最后将磁珠重悬在含有0.02％Na3N，0.1％牛血清白蛋白(BSA)的PBST缓冲液中，用于后续实验，免疫磁珠保存于4℃冰箱，尽量在一周之内使用。优选地，步骤3)中的LAMP反应体系设置为25μL，按照N+2个数量计算各组分用量，其中N个待检样品+1个阴性对照+1个阳性对照，将反应液置于1.5mL离心管中，漩涡混匀，离心30秒，分装于0.2mLPCR管中，并向每管加入约20μL矿物油，然后加入2μL提取的金黄色葡萄球菌基因组，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行扩增反应。优选地，LAMP反应体系成分为：2×RM反应液12.5μL，ddH2O8μL，引物1μL，SYTO-9工作液0.5μL，BstDNA聚合酶1μL，待检测DNA2μL。优选地，所述引物序列如下：F3引物：GGATGGCTATCAGTAATGTT；B3引物：GCTAAGCCACGTCCATAT；FIP引物：ACTGTTGGATCTTCAGAACCACCGCTACTAGTTGCTTAGTGTTA；BIP引物：AGCGATTGATGGTGATACGGTTCAGGACCATATTTCTCTACACC；LoopF引物：TGCTGAGCTACTTAGACTTGAA；LoopB引物：AGGTCAACCAATGACATTCAGA。另一方面，本专利技术还公开了一种基于智能恒温扩增技术检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，该试剂盒包括：免疫磁珠，DNA提取试剂，LAMP反应液，阳性对照和阴性对照。其中，所用免疫磁珠的制备方法为：颠倒混匀PBS溶液中的500nm链霉亲和素磁珠，吸取50μl的链霉亲和素磁珠加入1.5ml灭菌离心管中；然后加1ml0.01mol/LPBST缓冲液，洗涤磁珠，磁场吸附，弃上清液；将磁珠重悬于1ml0.01mol/LPBST缓冲液，加入20μl含生物素标记的金黄色葡萄球菌的多克隆抗体，垂直混匀仪上轻柔振荡，在室温下孵育45分钟；在磁场吸附，弃去上清液；后加入0.01mol/LPBST缓冲液(每次1ml)洗涤磁珠3次，每次5min，磁场吸附，弃去上清液；最后将磁珠重悬在含有0.02％Na3N，0.1％牛血清白蛋白(BSA)的PBST缓冲液中，用于后续实验，免疫磁珠保存于4℃冰箱，尽量在一周之内使用。优选地，LAMP反应液成分为：2×RM反应液12.5μL，ddH2O8μL，引物1μL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于包括如下步骤：1)利用免疫磁珠富集金黄色葡萄球菌:取1mL待测样品于1.5mL离心管中,投入免疫磁珠300μL混匀；垂直混匀仪上室温孵育30min后，将其置于磁力架上3min使磁珠充分吸附后，将上清液弃去，取下磁力架上的离心管，加入1mL的0.01mol/L PBS洗涤悬浮，充分混匀，然后置于磁力架上3min，使磁珠充分吸附后，弃去悬浮液，重复洗涤3次，加入1mL 0.01mol/LPBS震荡重悬磁珠，将富集得到的磁珠‑菌体复合物用于后续的DNA提取及环介导等温扩增法(LAMP)的检测；2)对富集的金黄色葡萄球菌进行DNA提取:采用市售的DNA提取试剂盒提取磁珠‑菌体复合物的DNA，其原理是基于硅胶柱纯化方式，利用试剂盒中的溶菌酶(Lysozyme)消化去除金黄色葡萄球菌的细胞壁，在裂解液和蛋白酶(Proteinase K)作用下裂解消化，DNA释放到裂解液中；加入乙醇后，转移至吸附柱(Column)中过滤，DNA被吸附至吸附柱的膜上，而蛋白质则被去除；吸附柱经洗涤后去除其他杂质，最后通过低盐缓冲液洗脱DNA，洗脱的DNA可直接用于后续的LAMP的检测；3)对提取的金黄色葡萄球菌的DNA进行LAMP检测:使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃15s，63℃45s作为一个循环，于63℃45s处收集荧光信号，30个循环；反应完成后，根据机器绘制的扩增曲线判断扩增结果，若出现“S”形曲线则为阳性扩增，而获得线性或稍微倾斜的扩增曲线则为阴性扩增。...

【技术特征摘要】
1.一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于包括如下步骤：1)利用免疫磁珠富集金黄色葡萄球菌:取1mL待测样品于1.5mL离心管中,投入免疫磁珠300μL混匀；垂直混匀仪上室温孵育30min后，将其置于磁力架上3min使磁珠充分吸附后，将上清液弃去，取下磁力架上的离心管，加入1mL的0.01mol/LPBS洗涤悬浮，充分混匀，然后置于磁力架上3min，使磁珠充分吸附后，弃去悬浮液，重复洗涤3次，加入1mL0.01mol/LPBS震荡重悬磁珠，将富集得到的磁珠-菌体复合物用于后续的DNA提取及环介导等温扩增法(LAMP)的检测；2)对富集的金黄色葡萄球菌进行DNA提取:采用市售的DNA提取试剂盒提取磁珠-菌体复合物的DNA，其原理是基于硅胶柱纯化方式，利用试剂盒中的溶菌酶(Lysozyme)消化去除金黄色葡萄球菌的细胞壁，在裂解液和蛋白酶(ProteinaseK)作用下裂解消化，DNA释放到裂解液中；加入乙醇后，转移至吸附柱(Column)中过滤，DNA被吸附至吸附柱的膜上，而蛋白质则被去除；吸附柱经洗涤后去除其他杂质，最后通过低盐缓冲液洗脱DNA，洗脱的DNA可直接用于后续的LAMP的检测；3)对提取的金黄色葡萄球菌的DNA进行LAMP检测:使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃15s，63℃45s作为一个循环，于63℃45s处收集荧光信号，30个循环；反应完成后，根据机器绘制的扩增曲线判断扩增结果，若出现“S”形曲线则为阳性扩增，而获得线性或稍微倾斜的扩增曲线则为阴性扩增。2.如权利要求1中所述快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤1)中所用免疫磁珠的制备方法为：颠倒混匀PBS溶液中的500nm链霉亲和素磁珠，吸取50μl的链霉亲和素磁珠加入1.5ml灭菌离心管中；然后加1ml0.01mol/LPBST缓冲液，洗涤磁珠，磁场吸附，弃上清液；将磁珠重悬于1ml0.01mol/LPBST缓冲液，加入20μl含生物素标记的金黄色葡萄球菌的多克隆抗体，垂直混匀仪上轻柔振荡，在室温下孵育45分钟；在磁场吸附，弃去上清液；后加入0.01mol/LPBST缓冲液(每次1ml)洗涤磁珠3次，每次5min，磁场吸附，弃去上清液；最后将磁珠重悬在含有0.02％Na3N，0.1％牛血清白蛋白(BSA)的PBST缓冲液中，用于后续实验，免疫磁珠保存于4℃冰箱，尽量在一周之内使用。3.如权利要求1中所述快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：步骤3)中的LAMP反应体系设置为25μL，按照N+2个数量计算各组分用量，其中N个待检样品+1个阴性对照+1个阳性对照，将反应液置于1.5mL离心管中，漩涡混匀，离心30秒，分装于0.2mLPCR管中，并向每管加入约20μL矿物油，然后加入2μL提取的金黄色葡萄球菌基因组，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行扩增反应。4.如权利要求3中所述快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，LAMP反应体系成分为：2×RM反应液12.5μL，ddH2O8μL，引物1μL，SYTO-9工作液0.5μL，BstDNA聚合酶1μL，待检测DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕观，张璜，郑聖腾，陈洵，石磊，常彦磊，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44