一种细胞毒性T细胞的制备方法技术

一种细胞毒性T细胞的制备方法，属于细胞制备方法技术领域。包括以下步骤：1)将血浆进行PBMC细胞培养；2)CTL细胞培养第一天；3)CTL细胞收获与冷冻。上述一种细胞毒性T细胞的制备方法法，其使用磁珠分离法筛选剔除无用的细胞并配合多种白介素以及Lymacin‑T的方法，相较已有的培养方法具有大幅提高CTL细胞的产量以及纯度的优点。

A preparation method of cytotoxic T cells

【技术实现步骤摘要】
一种细胞毒性T细胞的制备方法
本专利技术属于细胞制备方法
，具体为一种细胞毒性T细胞的制备方法。
技术介绍
细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte)专门分泌各种细胞因子参与免疫作用，对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用。可连续杀伤靶细胞，具有高效性。现有方法制备CTL细胞，产量偏低，纯度不高。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术的目的在于设计提一种细胞毒性T细胞的制备方法法的技术方案，其使用磁珠分离法筛选剔除无用的细胞并配合多种白介素以及Lymacin-T的方法，相较已有的培养方法具有大幅提高CTL细胞的产量以及纯度的优点。所述的一种细胞毒性T细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)将血浆进行PBMC细胞培养；2)CTL细胞培养第一天：a.PBMC细胞培养经过22-26小时，用移液器轻微的收获细胞；制备培养液A：在3.8-4.2℃下向480-520mlhanks平衡液中加入1.8-2.2ml25％人体白蛋白，0.371-0.373gEDTA摇匀；用移液器转移培养液A清洗培养瓶底部；b.用50ml试管离心细胞5-6分钟，380-420本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞毒性T细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)将血浆进行PBMC细胞培养；2)CTL细胞培养第一天：a.PBMC细胞培养经过22‑26小时，用移液器轻微的收获细胞；制备培养液A：在3.8‑4.2℃下向480‑520ml hanks平衡液中加入1.8‑2.2ml 25％人体白蛋白，0.371‑0.373g EDTA摇匀；用移液器转移培养液A清洗培养瓶底部；b.用50ml试管离心细胞5‑6分钟，380‑420g，4℃，吸取弃用上层液体，用2‑10ml的培养液A使细胞重新悬浮，计算细胞数以及存活率；c.离心试管5‑6分钟，380‑420g，4℃，计算所需培养液，取决于细胞数；培养液种...

【技术特征摘要】
1.一种细胞毒性T细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)将血浆进行PBMC细胞培养；2)CTL细胞培养第一天：a.PBMC细胞培养经过22-26小时，用移液器轻微的收获细胞；制备培养液A：在3.8-4.2℃下向480-520mlhanks平衡液中加入1.8-2.2ml25％人体白蛋白，0.371-0.373gEDTA摇匀；用移液器转移培养液A清洗培养瓶底部；b.用50ml试管离心细胞5-6分钟，380-420g，4℃，吸取弃用上层液体，用2-10ml的培养液A使细胞重新悬浮，计算细胞数以及存活率；c.离心试管5-6分钟，380-420g，4℃，计算所需培养液，取决于细胞数；培养液种类和用量：A1：每2x10^7PBMC，培养液A用量200ul；B：每2x10^7PBMC，自体血清用量40ul；C：每2x10^7PBMC，混合抗体用量40ul；D：每2x10^7PBMC，培养液A用量4ml；E：每2x10^7PBMC，培养液A用量200ul；F：每2x10^7PBMC，磁珠用量200ul；G：每2x10^7PBMC，培养液A用量2ml；即使细胞数没有达到2x10^7，也要使用这个数量的培养液；离心结束后，吸取弃用上层液体，用A1使细胞悬浮，加入B，加入C，均匀混合后，在冰上培养18-22分钟；20分钟后，加入D，离心试管4-6分钟，380-420g，4℃；d.离心结束后，吸取弃用上层液体，加入培养液A1使细胞重新悬浮，加入洗好的磁珠，紧紧的扣好盖子；在室温下培养14-16分钟，并轻轻地转动；培养结束后，用1ml移液器头使绑在磁珠上的细胞重新悬浮10次；加入G，把试管壁上的磁珠清洗到溶液中，把试管放入磁铁1.5-2.5分钟，把上层含有CD+8细胞的液体转移到一个新的50ml试管中；e.加入1-1.2ml培养液A，把试管壁上的磁珠清洗到溶液中，把试管放入磁铁1.5-2.5分钟，把上层含有CD+8细胞的液体转移到试管中；离心CD+8细胞试管4-6分钟，380-420g，4℃；吸取弃用上层液体，加入6-8mlG，用移液器温柔的使其悬浮10次，把试管放入磁铁1.5-2.5分钟以移除磁珠；f.转移细胞到一个新的15ml试管中，离心试管4-6分钟，380-420g，4℃，吸取弃用上层液体，用2-10ml的培养液A使细胞重新悬浮，计算细胞数和存活率；离心试管4-6分钟，380-420g，4℃；g.准备细胞培养液保存在室温下，细胞培养液采用8-12％自体血清，1800-2200IU/mlIL-2，480-520IU/mlIL-6，480-520IU/mlIL-12，ALyS505N-0混合制成；向CTL培养瓶里加入8-12ml的5ug/mlLymacin-T，扣上盖子，前后温柔的摇晃AT培养瓶直到液体覆盖整个底部，放在室温静置培养1.8-2.2小时；离心过后，吸取弃用上层液体，用培养液使细胞重新悬浮，把细胞悬浊液转移到CTL培养瓶内，培养细胞瓶11-13天，,36-38℃，5％CO2；3)CTL细胞收获与冷冻。2.如权利要求1所述的一种细胞毒性T细胞的制备方法，其特征在于步骤1)具体包括以下步骤：1)...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨罕闻，
申请(专利权)人：兰莲杭州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33