一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法及其应用，该制备方法包括以下步骤：1、制取丝素蛋白水溶液并浓缩；2、将丝素蛋白水溶液与辣根过氧化物酶溶液和双氧水制得混合溶液；3、将混合溶液成型，并放入28‑45℃下的温度环境下交联，再冷冻处理，得到丝素蛋白初成型品；4、将丝素蛋白初成型品放入甲醇溶液浸泡后再水洗，得到丝素蛋白成型品；5、使用原位矿化的方法在丝素蛋白成型品上合成纳米级羟基磷灰石颗粒，得到丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。本发明专利技术的制备方法采用操作简单、成品率高、无毒性的方法制备丝素蛋白复合羟基磷灰石骨导管，可有效治疗连续骨缺损，且可避免自体骨提取存在的风险以及同种异体骨存在的排异反应。

Preparation and Application of a Silk Fibroin Composite Hydroxyapatite Material

【技术实现步骤摘要】
一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法及其应用
本专利技术涉及材料化学、医用高分子功能材料
，具体涉及一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法及其应用。
技术介绍
在现代的对骨损伤修复的研究中，如何重建骨骼，促进骨愈合，须从4个基本要素出发加以考虑：①骨传导基质；②骨诱导因子；③成骨细胞植入合适的环境后就可直接形成新骨；④稳定的生物力学环境。目前临床上，多以移植自体骨或同种异体骨作为主要治疗手段。自体骨治疗一直被认为是植骨的最佳选择，但自体骨取材有限、切取供移植的骨骼时难免增加失血量、手术时间增长给病人增加痛苦，以及供区部位还会有一定的不适，甚至出现并发症等。而使用同种异体骨移植则有着愈合周期长，配型困难，容易发生排异反应等缺点为解决自体骨和同种异体骨的存在缺陷，使用骨导管对缺损的骨组织进行引导再生治疗已经逐渐被研究者们所关注。研究表明生物骨导管膜在大范围骨缺损修复的应用中，能起到隔离非骨生长的生物学环境，减少其他因素对骨形成的干扰管内也可添加对新骨形成有利的物质使得骨的修复更加快速、完整。在骨损伤的修复中，有研究证明了在以纳米纤维素为基底的生物材料中复合进促成骨细胞生长因子，便能更好的诱导骨缺损部位的再生。目前有多种类似于骨导管或机理相似的生物膜材料已经应用于筋腱、血管、关节软骨以及骨头的修复之中。已有研究表明例如改进的聚乳酸/聚乙醇酸高聚物膜、胶原蛋白与多孔钛的复合膜、壳聚糖生物电膜对于生物体内的骨损伤修复具有一定的促进作用。然而，较差的生物相容性与力学性能，以及会过早的在体内降解限制了这些材料的应用。丝素蛋白是从蚕茧中提取的绿色可再生资源，具有良好的机械性能和优秀的生物相容性等特点而受到广大科学家的关注，丝蛋白中含有18种氨基酸，主要为甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser)以及酪氨酸(Tyr)对人体的免疫反应低，是优秀的生物材料良好的力学性能和体内可生物降解性。丝素蛋白占蚕丝总量的70％～80％左右，是可再生的天然高分子材料。这使其在各种组织尤其是骨组织的修复中表现出众；羟基磷灰石作为生物骨骼中无机组分的主要成分，具有优良的生物相容性和生物活性，在体内有一定的溶解度，释放对机体无害的离子，可参与体内代谢，对新骨形成有刺激、诱导作用，可作为一种骨骼的诱导因子与材料复合制备出具有促成骨活性的支架。基于此，丝素蛋白和羟基磷灰石的复合逐渐受到研究者的重视。随着纳米技术的发展，研究者通过钙、磷交替浸泡法将含钙、磷化合物与丝素蛋白混合成功制备了丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合纳米纤维材料，可用于骨组织细胞的培养。综上所诉，酶交联的表面原位合成羟基磷灰石纳米颗粒的丝素蛋白骨导管在大范围骨缺损的修复治疗方面有良好的应用前景。现有技术中，因丝素蛋白大分子链为两亲性分子，其溶液具有较强的环境敏感性，温度、pH、超声、有机溶剂及本身浓度较高都会引起丝素蛋白水溶液的凝胶化，且丝素蛋白分子量越大或自身浓度过高更易引起其凝胶化的出现，而溶液本身浓度又是影响材料力学性能重要因素之一。有研究者通过丝素蛋白与其他高分子材料(如：壳聚糖、聚乙二醇等)相复合从而得到力学性能较为优异的丝素蛋白复合材料，但壳聚糖、聚乙二醇的体内降解情况又是必须考虑的问题之一，因此如何提高浓度来得到优异力学性能的丝素蛋白材料是现今科学家们关注的热点之一。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法，操作简单、成品率高、无毒性的方法制备丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。本专利技术的目的之二在于提供一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的应用，将丝素蛋白复合羟基磷灰石材料应用于骨修复领域，可有效治疗连续骨缺损，且可避免自体骨提取存在的风险以及同种异体骨存在的排异反应。本专利技术实现目的之一所采用的方案是：一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法，包括以下步骤：(1)制取丝素蛋白水溶液并浓缩至一定浓度；(2)将所述步骤(1)制备的丝素蛋白水溶液与辣根过氧化物酶溶液和双氧水按照一定比例混合均匀，制得混合溶液；(3)将所述步骤(2)的混合溶液倒入模具成型，并放入28-45℃下的温度环境下交联，再放入(-18)-(-50)℃环境下冷冻处理，得到丝素蛋白初成型品；(4)将所述步骤(3)的丝素蛋白初成型品放入甲醇溶液浸泡后再水洗除去多余甲醇，得到丝素蛋白成型品；(5)使用原位矿化的方法在所述步骤(4)的丝素蛋白成型品上合成纳米级羟基磷灰石颗粒，得到所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。本专利技术的制备方法通过浓缩提高丝素蛋白水溶液的浓度的方法来提高丝素蛋白材料力学性能，使本专利技术制备的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料可完全被人体吸收降解，对机体无毒。本专利技术的制备方法是将辣根过氧化物酶和双氧水依次与丝素蛋白水溶液混合均匀后注入模具中并放置于一定温度下使其交联形成凝胶。随后将酶交联的丝素蛋白凝胶放入(-18)-(-50)℃条件下冷冻3～4h后浸泡在甲醇溶液中1～2h，使部分丝素蛋白大分子链形成-折叠构象，进而提高丝素蛋白材料的力学性能。最后通过溶液交替浸泡，在丝素蛋白材料上原位矿化羟基磷灰石颗粒(HAP)，从而制得丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。根据材料良好的生物相容性、优异的力学性能和能够在体内屏蔽的特点，将其应用在大范围的骨缺损修复治疗中。本专利技术的制备方法制得的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料具有良好的力学性能可用于大范围骨缺损的修复，丝素蛋白生物相容性好，可被人体降解吸收，降解产物为氨基酸，对机体不仅无毒性，还可有助于加快骨缺损部位的修复；原位合成在丝素蛋白基体中的羟基磷灰石具有骨诱导性，可促进成骨细胞的增殖分化，有助于骨的再生修复。优选地，所述步骤(1)中，丝素蛋白水溶液的浓缩步骤如下：将制取的丝素蛋白水溶液装入截留分子量为8000～14000的透析袋中，并在1-5℃下吹风使丝素蛋白水溶液浓缩至浓度为6wt％-30wt％。本专利技术的浓缩方法在克服了丝素蛋白水溶液浓度过高会凝胶化的缺点，并且不添加稳定剂和其他高分子材料，方法简单，成本低廉，制备出了最高浓度为30wt％的丝素蛋白水溶液，为制备处高力学性能的纯丝素蛋白材料提供了基础。优选地，所述步骤(2)中，辣根过氧化物酶溶液的活性浓度为900U/mL，双氧水的浓度为0.5wt％，丝素蛋白水溶液、辣根过氧化物酶溶液和双氧水的体积比为1:0.02:0.02。优选地，所述步骤(5)中，原位矿化的步骤如下：将所述步骤(4)的丝素蛋白成型品先在含钙离子的溶液中浸泡，取出后水洗除去多余的含钙离子的溶液，再在含磷酸根离子的溶液中浸泡，取出后水洗除去多余的含磷酸根离子的溶液，再在含钙离子的溶液中浸泡，如此循环多次后得到所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。优选地，所述含钙离子的溶液为浓度为200mM的CaCl2水溶液，所述含磷酸根离子的溶液为浓度为200mM的Na2HPO4水溶液。优选地，所述步骤(5)中，丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的羟基磷灰石颗粒粒径为800～1100nm，丝素蛋白复合羟基磷灰石材料中羟基磷灰石的质量百分数为9％-16％。优选地，所述步骤(5)中，丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的孔径为20-40μm。本专利技术实现目的之二所采用的方案是：一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的应用，将所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料用于骨修复领域，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制取丝素蛋白水溶液并浓缩至一定浓度；(2)将所述步骤(1)制备的丝素蛋白水溶液与辣根过氧化物酶溶液和双氧水按照一定比例混合均匀，制得混合溶液；(3)将所述步骤(2)的混合溶液倒入模具成型，并放入28‑45℃下的温度环境下交联，再放入(‑18)‑(‑50)℃环境下冷冻处理，得到丝素蛋白初成型品；(4)将所述步骤(3)的丝素蛋白初成型品放入甲醇溶液浸泡后再水洗除去多余甲醇，得到丝素蛋白成型品；(5)使用原位矿化的方法在所述步骤(4)的丝素蛋白成型品上合成纳米级羟基磷灰石颗粒，得到所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。

【技术特征摘要】
1.一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制取丝素蛋白水溶液并浓缩至一定浓度；(2)将所述步骤(1)制备的丝素蛋白水溶液与辣根过氧化物酶溶液和双氧水按照一定比例混合均匀，制得混合溶液；(3)将所述步骤(2)的混合溶液倒入模具成型，并放入28-45℃下的温度环境下交联，再放入(-18)-(-50)℃环境下冷冻处理，得到丝素蛋白初成型品；(4)将所述步骤(3)的丝素蛋白初成型品放入甲醇溶液浸泡后再水洗除去多余甲醇，得到丝素蛋白成型品；(5)使用原位矿化的方法在所述步骤(4)的丝素蛋白成型品上合成纳米级羟基磷灰石颗粒，得到所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。2.根据权利要求1所述的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，丝素蛋白水溶液的浓缩步骤如下：将制取的丝素蛋白水溶液装入截留分子量为8000～14000的透析袋中，并在1-5℃下吹风使丝素蛋白水溶液浓缩至浓度为6wt％-30wt％。3.根据权利要求1所述的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，辣根过氧化物酶溶液的活性浓度为900U/mL，双氧水的浓度为0.5wt％，丝素蛋白水溶液、辣根过氧化物酶溶液和双氧水的体积比为1:0.02:0.02。4.根据权利要求1所述的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中，原位矿化的步骤如下：将所述步骤(4)的丝素蛋白成型品先在含钙离子的溶液中浸泡，取出后水洗除去多余的含钙离子的...

【专利技术属性】
技术研发人员：常春雨，徐瑞，郑博文，肖凌飞，蔡林，张俐娜，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42