一种提高水稻黑条矮缩病毒病发病率的方法技术

本发明专利技术涉及农业领域，具体涉及一种提高水稻黑条矮缩病毒病发病率的新方法，所述方法包括步骤：(1)将萌芽的水稻种子进行种植，生长至二～三叶期；(2)用二苯基氯化碘盐均匀喷洒水稻叶；(3)将水稻材料饲喂携带RBSDV的灰飞虱；(4)移去水稻上所有的灰飞虱；(5)接毒材料移栽到恒温温室中，光照；(6)通过RT‑PCR检测确定水稻植株的感病情况。

A Method for Increasing the Incidence Rate of Rice Black-streaked Dwarf Virus Disease

【技术实现步骤摘要】
一种提高水稻黑条矮缩病毒病发病率的方法
本专利技术涉及农业领域，具体涉及一种提高水稻黑条矮缩病毒病发病率的新方法。技术背景水稻黑条矮缩病毒(Riceblack-streakeddwarfvirus,RBSDV)是斐济病毒属(Fijivirus)的成员之一，是一种严重危害水稻产量的双链RNA病毒。水稻在感染RBSDV后，植株表现出明显的矮缩，分蘖增多，叶色浓绿。RBSDV病毒粒子为典型的正二十面体球状结构，含内外两层衣壳，基因组包含10条双链RNA(doublestrandRNA，dsRNA)，按其在凝胶上的电泳迁移率由慢至快依次命名为S1～S10。除了S5、S7及S9包含两个开放阅读框(openreadingframes，ORF)外，其他的基因分别编码一个蛋白。S1、S2及S3分别编码一个RNA依赖的RNA聚合酶(P1)、一个核心蛋白(P2)及一个加帽酶(P3)。S4、S8及S10分别编码病毒的结构蛋白B-刺突(P4)、病毒粒子的核心蛋白(P8)及外壳蛋白(P10)。P1、P2、P3、P4、P8和P10这6个蛋白是病毒粒子的结构蛋白。S7编码的P7-1蛋白为管状结构，与病毒在细胞间的运动有关，P7-2具有核定位信号的功能。P5-1、P6和P9蛋白共同组成病毒质作为病毒复制组装的场所。水稻黑条矮缩病毒由介体灰飞虱(LaodelphaxStriatellus)进行传播，不经卵传播。RBSDV寄主范围很广泛，包括水稻、玉米、小麦、大麦等主要粮食作物等共60多种禾本科作物。目前主要侵染玉米和水稻两种重要的经济作物，严重危害我国的粮食安全。RBSDV侵染植物后引起植株矮小，分蘖增多，结实率低，发病后期在叶背面会出现白色瘤状隆起。RBSDV侵染水稻后会引起水稻黑条矮缩病毒病，侵染玉米后会引起玉米粗缩病。研究发现，近年来，随着气温不断升高，病毒传播介体灰飞虱密度增大及单一的耕作制度，使得水稻黑条矮缩病发生越来越严重。目前除了通过喷洒杀虫剂来降低传毒介体灰飞虱的虫口密度，还未找到有效的防治该病的方法，但喷施杀虫剂会带来严重的农药残留问题。因此，加强对RBSDV致病机制的研究，引起了科研工作者的高度关注。二苯基氯化碘盐(Diphenyleneiodoniumchloride，DPI)是一种NADPH氧化酶(由RBOH基因编码)抑制剂，也是一种TRPA1激活剂，其通过抑制NADPH氧化酶活性，减少细胞中O2-的产生，从而降低活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)的积累。近年研究显示，ROS除了作为植物代谢过程中一种有毒害作用的物质外，它还在植物应对病原菌的防卫反应中发挥着重要作用。ROS在植物应激反应中充当第二信使的作用，水稻中较高基础水平的ROS积累能增强水稻对RBSDV侵染的抗性。二苯基氯化碘盐会抑制ROS的积累，然而，目前关于二苯基氯化碘盐能提高水稻黑条矮缩病毒病发病率并没有报道。
技术实现思路
为了提供一种水稻黑条矮缩病毒发病率高的水稻，以便为更好的研究该病毒病提供有力条件，本专利技术提供一种利用二苯基氯化碘盐提高水稻黑条矮缩病毒病发病率的新方法。所述方法包括步骤：(1)将萌芽的水稻种子进行种植，生长至二～三叶期；(2)用二苯基氯化碘盐均匀喷洒水稻叶；(3)将水稻材料饲喂携带RBSDV的灰飞虱；(4)移去水稻上所有的灰飞虱；(5)接毒材料移栽到恒温温室中，光照；(6)通过RT-PCR检测确定水稻植株的感病情况。其中所述步骤(1)中：所述水稻优选为淮稻5号、日本晴、武育粳3号等粳稻品种；所述水稻种植所需时间8-15天；其中所述步骤(2)中：所述二苯基氯化碘盐为用tritonX-100稀释，更为优选的，所述tritonX-10浓度为0.1％。所述喷洒步骤重复次数为2-4次，每次时间间隔为20-30小时，优选为24小时。其中在所述步骤(3)中：所述将水稻材料饲喂携带RBSDV的灰飞虱是在步骤(2)进行10-20小时后进行，优选为12-16小时。所述步骤(3)中饲喂携带RBSDV的灰飞虱的时间为2-5天，最有选为3天。所述步骤(5)中：所述恒温室的温度为28-32℃，最优选为30℃。所述光照时间为10-15小时，优选为12小时。本专利技术所述的优选所述二苯基氯化碘盐是用0.1％的tritonX-100将二苯基氯化碘盐稀释到100μM使用，优选二苯基氯化碘盐提前用DMSO溶解成100mM母液。优选，本次实验中所使用的水稻为淮稻5号。优选的，在一个具体的实施方案中，本专利技术所述具体方法为：将萌芽的水稻种子种在1L烧杯中生长10天左右(二～三叶期)，每杯包含四十颗左右的水稻种子，共有四杯。分别将0.1％的tritonX-100溶液和用0.1％的tritonX-100稀释到100μM的二苯基氯化碘盐用小喷壶均匀喷洒在水稻叶片上，每隔24小时喷一次，共处理三次，每个处理含三个生物学重复。叶片喷施容量25mL/杯，即液体浸湿整个叶片，叶片上开始滴水为止。二苯基氯化碘盐处理12-16小时后，将水稻材料饲喂健康和携带RBSDV的灰飞虱。具体处理方案如下表1。健康及带毒灰飞虱在水稻苗上饲喂3天后，移去水稻上所有的灰飞虱，接毒材料移栽到30℃的恒温温室中，光照12小时，45天以后进行症状观察。通过RT-PCR检测确定水稻植株的感病情况。本专利技术的优点：水稻黑条矮缩病毒由介体灰飞虱进行传播，但不经过卵传，所以我们室内接种RBSDV时，需要大量RBSDV侵染的水稻用来作为饲喂无毒灰飞虱的毒源。但秋冬季气温较低，田间水稻黑条矮缩病发病率很低，不易找到带毒的水稻材料。本研究是从提高水稻黑条矮缩病毒病发病率的角度出发，外源喷施二苯基氯化碘盐后增加感病水稻的数量，从而为我们室内接种RBSDV实验提供充足的毒源。为我们更好的研究该病毒病提供有力的条件。名词释义：TritonX-100也叫曲拉通X-100，为聚氧乙烯单-4-辛基苯基醚。附图说明图1为健康水稻植株(左)和RBSDV侵染水稻植株(右)；图2为对照组A2水稻植株带毒检测，其中M，Marker；+，携带RBSDV的水稻植株阳性对照；-，健康的水稻植株对照；1-22，0.1％TritonX-100处理后接种RBSDV的植株；图3为处理组B2水稻带毒检测情况，其中M，Marker；+，携带RBSDV的水稻植株阳性对照；-，健康的水稻植株对照；1-23，10μM二苯基氯化碘盐的0.1％tritonX-100溶液处理后接种RBSDV的植株；图4为处理组C2水稻带毒检测情况，其中M，Marker；+，携带RBSDV的水稻植株阳性对照；-，健康的水稻植株对照；1-22，100μM二苯基氯化碘盐的0.1％tritonX-100溶液处理后接种RBSDV的植株。具体实施方法实例1灰飞虱获毒(RBSDV)方法1.将成虫饲养在10天(二～三叶期)的武育粳3号水稻苗上产卵，一般3-4天后将灰飞虱成虫从烧杯中全部移除。2.产卵8-10天后，武育粳3号水稻苗上即可孵化出幼虫。灰飞虱长到1-2龄，可用来获得RBSDV。具体操作：水稻黑条矮缩病毒的病苗(提前将茎清理干净，把干枯的叶鞘剪掉，尽量露出比较新鲜的茎，把水吸干净)移栽到5L的烧杯中，将武育粳3号水稻苗上1-2龄幼虫扫到感染水稻黑条矮缩病毒的病株上饲毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高水稻黑条矮缩病毒病发病率的方法，所述方法包括步骤：(1)将萌芽的水稻种子进行种植，生长至二～三叶期；(2)用二苯基氯化碘盐均匀喷洒水稻叶；(3)将水稻材料饲喂携带RBSDV的灰飞虱；(4)移去水稻上所有的灰飞虱；(5)接毒材料移栽到恒温温室中，光照；(6)通过RT‑PCR检测确定水稻植株的感病情况。

【技术特征摘要】
1.一种提高水稻黑条矮缩病毒病发病率的方法，所述方法包括步骤：(1)将萌芽的水稻种子进行种植，生长至二～三叶期；(2)用二苯基氯化碘盐均匀喷洒水稻叶；(3)将水稻材料饲喂携带RBSDV的灰飞虱；(4)移去水稻上所有的灰飞虱；(5)接毒材料移栽到恒温温室中，光照；(6)通过RT-PCR检测确定水稻植株的感病情况。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(1)中：所述水稻优选为淮稻5号、日本晴、武育粳3号等粳稻品种。3.根据权利要求1所述的方法，所述水稻种植所需时间8-15天。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(2)中：所述二苯基氯化碘盐为用tritonX-100稀释。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述tritonX-10浓度为0.1％。6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙宗涛，张合红，谭小香，李俊敏，陈剑平，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33