一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法及其应用组成比例

本发明专利技术提供一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法及其应用，属于环境微生物技术领域。具体步骤是：分别提取堆肥原料和备选菌剂的DNA，利用荧光定量PCR分别扩增其16 S DNA和纤维素酶基因，以16 S DNA作为内参，根据溶解曲线法计算菌剂中纤维素酶基因的相对含量。当相对含量大于0.05时，该菌剂适用于该堆体的堆肥化处理，当相对含量小于0.05时，需要向菌剂中添加具有纤维素降解功能的细菌。该方法可评价菌剂的适用性，较盲目施加菌剂具定向、精准、灵活的优势，显著提高了菌剂的功效。在牛粪等高纤维物料的堆肥资源化方面具有广阔的应用前景。

A Compound Method of Composting Bacteria Agent for High Fiber Material and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法及其应用
本专利技术涉及环境微生物
，特别涉及一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法及其应用。
技术介绍
纤维素是地球上及其丰富并且可再生的资源之一。在我国，农业和养殖业的集约化建设和快速发展，使得农作物秸秆、园林废弃物、畜禽粪污等富含纤维素的有机废弃物的污染日益严重。例如，在一些地方，牛粪对环境的污染已超过了工业污染的总量。堆肥化处理，是指在人工控制的条件下，依靠自然界中广泛分布的细菌、放线菌、真菌等微生物，人为地促进可生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的微生物学过程。有机废弃物经过好氧堆肥处理后：1）有机质分解转化为腐殖质，更利于植物吸收利用；2）有机废弃物中的致病菌、寄生虫等会被杀死。用有机废弃物做原料生产有机肥具有成本小、质量稳定、市场销售空间大等优势。因此，堆肥化已成为当前畜禽粪污等高纤维物料无害化、资源化处理最常用的方法。为了提高堆肥效率，目前最主要的策略是在堆肥初期人为接种微生物菌剂，以提高堆肥初期微生物的群落结构、增强微生物的降解活性，进而缩短达到高温期的时间及提高堆肥效率。例如，公开号CN102409005A公布了一株具有双重酶活并用于好氧堆肥发酵的高温菌，公开号CN105349462A公开了一株可有效提高堆体纤维素酶活性，并加快堆体纤维素降解的龙舌兰芽孢杆菌Hexi1。公开号CNIO7177533A公开了一种由嗜热脲芽孢杆菌剂、土芽孢杆菌剂、嗜热脱氮芽孢杆菌剂、红嗜热盐菌剂混合获得的嗜热菌复配菌剂。公开号CNIO6978366A公开了一种由脉芽孢杆菌菌株TB42、地衣芽孢杆菌菌株TA65和热反硝化地芽孢杆菌菌株TB62混合而成的菌剂等。然而，堆肥原料种类繁多，堆体成分复杂多变。例如，奶牛、黄牛和肉牛的牛粪在物质组成及微生物种群结构等方面均存在较大的差异。即便是同一种牛的牛粪，在不同的养殖地区，其物质组成及微生物种群结构也会存在较大的差异。市场中有限的菌剂难以应对如此多变的堆体原料，而且很少有菌剂在所有的牛粪堆肥化处理中都表现出优良的堆肥效果。当菌剂效果达不到预期时，为了提高堆肥效率，一些企业或单位要么更换菌剂，要么增加菌剂的用量等，这些措施不但造成菌剂浪费、增加堆肥成本，而且往往得不到预期的堆肥效果。在堆体成分难以统一及普适性菌剂匮乏的情况下，本专利技术建立了一套简单的、因堆体成分而异的菌剂配制、评价和优化的方法，将有效避免菌剂的浪费，降低堆肥成本并增强菌剂的使用效能、提高堆肥的效率及堆肥产物的肥效，在有机废弃物堆肥化处理领域具有潜在的应用价值，尤其适用于牛粪等高纤维物料的堆肥化处理。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法及其应用。本专利技术可通过以下技术方案实现:一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法，包括以下步骤：（1）分别提取堆肥原料和备选菌剂的DNA，利用分光光度仪和琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的浓度和质量；（2）利用荧光定量PCR扩增两种样品的16SDNA和纤维素酶基因，PCR扩增时，要求两种引物扩增条件下所用DNA模板的量相同，扩增循环数一致或PCR扩增条件；（3）堆体原料和备选菌剂的16SDNA的CT值分别定义为CT1a和CT1b，纤维素酶基因的CT值分别定义为CT2a和CT2b，以16SDNA作为内参，根据溶解曲线法计算菌剂中纤维素酶基因的相对含量，计算公式为；（4）当计算结果大于0.05，则该菌剂可直接用于堆肥，当结果低于0.05，可通过添加已报道的能够用于堆肥且具有分泌纤维素酶活性的菌株，使其结果值大于0.05，以提高当前菌剂在当前堆体中的功效。本专利技术的优点在于：利用本专利技术的制备方法，可在堆体成分难以统一及普适性菌剂有限的情况下，评价所购或自配菌剂对当前堆体的适用性能，有效避免菌剂的浪费，降低堆肥成本并增强菌剂的功效、提高的堆肥的效率及堆肥产物的肥效，在有机废弃物堆肥化处理领域具有潜在的应用价值，尤其适用于牛粪等高纤维物料的堆肥化处理。具体实施方式下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例1：菌剂的评价、复配及其在堆肥中的应用效果。1.实施例中所用LB培养基组成为：胰蛋白胨（10g/L），酵母提取物（5g/L），NaCl（10g/L），pH调为7.0，也可向其中加入20g/L琼脂粉，制成固体LB培养基。2.实施例中所涉及的引物：16SDNA扩增引物：27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）；纤维素酶扩增基因选自熊小龙同学的硕士论文《应用于宏基因组纤维素酶基因钓取的新PCR方法的构建》，位于第60页，即GHF9E1F（5'-GGACGTGACCGGCGGNTGGTAYGA-3'）和GHF9E1R（5'-GGCCATCCACACCAGAGGNGCRTTCCA-3'）。3.实施例中所涉及的菌株：特基拉芽孢杆菌菌株为在CGMCC编号为5935的菌株（见CN102719379A）；坚强芽孢杆菌菌株为在CGMCC编号为4772的菌株（见CN102337236A）。4.菌种活化：特基拉芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌分别接种于固体LB培养基，37℃培养24h，挑取单菌落至液体LB培养基中，37℃培养12h，12000rpm，1min，去除上清液后用1mL无菌水悬浮，稀释106倍后用血球计数板计数并调整菌体浓度约l×108个/mL。5.实施例中所用的菌剂为利用不能降解纤维素的大肠杆菌DH5α和可以降解纤维素的特基拉芽孢杆菌分别按体积比1000:1和10:1配置的纤维素降解菌含量存在明显差异的两种菌剂，含量相对低的命名为菌剂一，含量相对较高的命名为菌剂二。6.堆肥原料的牛粪采集于某奶牛牧场，将水稻秸秆和新鲜牛粪按体积比4:6混合制堆，调整含水量约为65%。7.分别称取0.5g堆肥原料和5g菌剂（约5ml），利用土壤DNA提取试剂盒（MPbiomedicals,116560-200）提取堆肥原料和两种菌剂的DNA，堆肥原料的DNA用30μl的溶解缓冲液溶解，菌剂的DNA用50μl的溶解缓冲液溶解，利用荧光定量PCR扩增16SDNA和纤维素酶基因扩增，退火温度为60℃，延伸时间为80s，循环次数为45次，荧光定量PCR检测试剂选用SYBRFastqPCRMix（RR430A，TaKaRa）。反应体系是按照荧光定量PCR检测试剂使用说明书添加，20μl总反应体系，其中，DNA模板2μl，一对引物各0.5μl，荧光定量PCR检测试剂10μl，无菌水7μl；8.以16SDNA作为内参，根据溶解曲线法计算菌剂一和菌剂二中纤维素酶基因的相对含量，分别为0.003和0.067；9.分别利用特基拉芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌调节菌剂一，使得菌剂中纤维素酶基因的相对含量分别为0.053和0.071：10.将堆肥原料平均分成4份，依次标记为T1、T2、T3、T4。每个处理组依次施加以下几种液体菌剂，添加比例为0.025%（以原始物料质量百分比计）。表1各接种菌剂组成11.堆肥进行20d，分别在第0、5、10、15、20d取样，测定了温度、pH、含水率、有机质、凯氏氮、无机氮、DOM含量等参数。整个堆肥过程只在0d接本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法，其特征在于，基于16 S DNA和纤维素酶基因，计算纤维素酶基因的相对含量，调节菌剂中纤维素降解菌的比例，进而提高堆肥效率及堆肥产物肥效。

【技术特征摘要】
1.一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法，其特征在于，基于16SDNA和纤维素酶基因，计算纤维素酶基因的相对含量，调节菌剂中纤维素降解菌的比例，进而提高堆肥效率及堆肥产物肥效。2.根据权利要求1所述的一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法，其特征在于，分别提取堆肥原料和备选菌剂的DNA，利用荧光定量PCR扩增16SDNA和纤维素酶基因。3.根据权利要求2所述的一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法，其特征在于，16SDNA扩增引物为常用的通用引物。4.根据权利要求2所述的一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法，其特征在于，纤维素酶基因扩增引物为适用于分泌纤维素酶的细菌的简并引物。5.根据权利要求2所述的一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：石振华，张琪，车建刚，廖斌斌，
申请(专利权)人：福建省致青生态环保有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35