携带ES/CD基因、具有肿瘤归巢性的靶向探针及其制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种携带ES/CD基因和SPIO‑PEG‑BsAb、具有肿瘤归巢性的靶向探针及其制备方法，与其在肝癌诊断和治疗中的应用。本发明专利技术首先合成内皮抑素(Endostatin)和自杀基因(CD)的融合基因重组慢病毒，将该慢病毒转染内皮祖细胞(EPC)，形成ES/CD‑EPC。再与合成的磁性纳米探针SPIO‑PEG‑BsAb(在超顺磁性纳米颗粒四氧化三铁(Fe3O4)表面进行PEG修饰，从而引入anti‑AFP和anti‑CD34抗体形成复合物SPIO‑PEG‑BsAb)结合形成SPIO‑PEG‑BsAb‑ES/CD‑EPC。本发明专利技术靶向探针EPC具有肿瘤归巢性，其携带ES/CD基因和SPIO‑PEG‑BsAb可同时靶向肝癌细胞和肿瘤血管，起到诊断加治疗的双重目的，为肿瘤基因治疗提供了一种崭新的活体监测手段，具备临床应用性和现实的治疗意义。

Targeting probes with ES/CD gene and homing ability of tumors and their preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
携带ES/CD基因、具有肿瘤归巢性的靶向探针及其制备与应用(一)
本专利技术涉及一种携带ES/CD基因和SPIO-PEG-BsAb、具有肿瘤归巢性的靶向探针及其制备方法，与其在肝癌诊断和治疗中的应用。(二)
技术介绍
肝细胞癌(HCC)是世界上第5大常见恶性肿瘤，为我国第3大常见恶性肿瘤。虽然手术治疗已取得了显著的疗效，但是，由于HCC发现时多为中晚期，手术切除率低，晚期患者即使行肝移植远期预后也欠佳。包括经肝动脉化疗栓塞术(TACE)、射频消融(RadioFrequencyAblation,FRA)在内的多种介入微创治疗方法已被广泛应用于临床，但5年生存率仍较低。以基因治疗为代表的生物靶向治疗为近年迅速发展起来的最有希望取得突破性进展的肿瘤治疗方法，在肝癌基因治疗方面，也取得了令人鼓舞的结果。其中胞嘧啶脱氨酶(CD)基因是研究较多的一种自杀基因，它可以通过表达胞嘧啶脱氨酶使无毒性的前药5-氟胞嘧啶(5-FC)转变为有毒性的5-氟尿嘧啶(5-FU)直接杀伤瘤细胞。另一方面，抗血管生成(anti-angiogenesis)治疗已成为肿瘤治疗的重要手段，由于大多数HCC肿瘤血管较为丰富，抗肿瘤血管生成治疗对于肝癌尤为重要。内皮抑素(Endostatin)是目前发现的抗血管生成活性最强的血管生成抑制因子之一，对肿瘤新生血管内皮细胞增殖的抑制作用特别强烈。应用Endostatin基因治疗肝癌也显示了令人振奋的结果。由于内皮抑素对肿瘤细胞无明显杀伤作用，因此，如能构建含CD基因和内皮抑素基因的融合基因则理论上既能直接杀伤肿瘤细胞，又能抑制肿瘤血管生成，应能取得更好疗效，更具临床价值。1997年Asahara首次从人外周血中分离出了内皮祖细胞(ndothelialprogenitorcell，EPC)，成人的脐血、胎肝、胎脾、外周血和骨髓均存有EPC。大量研究显示EPC在肝癌等各种肿瘤血管新生中起重要作用，利用EPC向肿瘤血管迁移的特性，以EPC为载体，把各种治疗基因特异性地导入肿瘤部位，可以有效地抑制肿瘤生长。Wei等把转染酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因的EPC注入肺癌转移小鼠尾静脉，显示小鼠生存期明显延长。EPC携带CD40配体可以进入肺转移瘤刺激肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素-γ的分泌，增加细胞凋亡蛋白酶-3/7的活性而抑制肿瘤。本申请团队前期研究结果也证明转染了内皮抑素基因的EPC能向肝癌组织归巢并能抑制肿瘤血管生成。所有以上研究均表明：EPC可以作为基因治疗的载体治疗肿瘤，而且具有许多优点：(1)靶基因可在体外转导，避免人体直接暴露于病毒质粒；(2)比较容易得到自体EPC，可重复使用，避免排斥反应，还可避免伦理学矛盾；(3)在体内通过整合EPC到增殖的血管网而使转导基因有扩增的可能，使治疗效应放大；(4)可以通过静脉输入，比较方便。目前细胞移植术业已进入临床应用，迫切需要对细胞进行活体追踪和监测。目前的活体细胞示踪方法中，MR由于分辨率高，应用前景看好。在应用MR进行细胞群示踪前，需要细胞体外标记示踪剂。超顺磁性氧化铁(superparamageticironoxide，SPIO)类纳米粒子是目前较理想的磁共振示踪剂。研究者在多种器官损伤及疾病动物模型上，采用MR示踪SPIO标记的各种干细胞均取得成功。这一细胞标记示踪技术也已在临床上初步显示了其安全性和有效性。Arbab等用MRI成功地活体示踪了标记SPIO的EPC在肿瘤血管形成中的表达。本研究团队也已完成了间充质干细胞(MSC)、EPC的SPIO标记及活体示踪，采用MR成像观察到了归巢至损伤血管内皮的EPC，采用SPIO标记了内皮抑素基因修饰的EPC，建立了肝癌动物模型进行了相关研究。基于以上理论和研究背景，并根据前期研究工作基础及发现的科学问题，本专利技术拟构建内皮抑素和自杀基因的融合基因重组慢病毒含ES/CD基因的重组慢病毒，体外转染EPC，然后以在超顺磁性纳米颗粒四氧化三铁(Fe3O4)表面进行PEG修饰，从而引入anti-AFP和anti-CD34抗体形成复合物SPIO-PEG-BsAb，再以SPIO-PEG-BsAb标记含ES/CD基因的重组慢病毒-EPC，将该EPC移植入肝癌小鼠体内，利用anti-AFP的免疫导向作用及EPC的肿瘤归巢性双重介导使EPC高效迁移到肝癌组织，发挥融合基因抑制肿瘤血管生成及直接杀伤肿瘤细胞的双重作用；同时采用磁共振(MR)成像活体监测EPC向肝癌组织的归巢过程。这将有可能为肝癌及其它恶性肿瘤的免疫导向EPC抗肿瘤基因治疗提供新思路和新途径。(三)
技术实现思路
为解决肝癌分子靶向显像和治疗的问题，本专利技术提供了一种一种携带ES/CD基因和SPIO-PEG-BsAb、具有肿瘤归巢性的靶向探针及其制备方法，与其在肝癌诊断和治疗中的应用。本专利技术采用的技术方案是：一种携带ES/CD基因、具有肿瘤归巢性的靶向探针，由如下方法获得：(1)合成内皮抑素(Endostatin)和自杀基因(CD)的融合基因重组慢病毒，将该慢病毒转染内皮祖细胞(EPC)，形成ES/CD-EPC；(2)在超顺磁性纳米颗粒四氧化三铁表面进行PEG修饰，并引入anti-AFP和anti-CD34抗体，形成复合物SPIO-PEG-BsAb；(3)步骤(1)ES/CD-EPC和步骤(2)SPIO-PEG-BsAb结合，得到SPIO-PEG-BsAb-ES/CD-EPC，即所述靶向探针。所述内皮抑素基因序列如SEQIDNo.1所示，所述自杀基因序列如SEQIDNo.2所示。SEQIDNo.1(552bp，无ATG，无TAG)：CATACTCATCAGGACTTTCAGCCAGTGCTCCACCTGGTGGCACTGAACACCCCCCTGTCTGGAGGCATGCGTGGTATCCGTGGAGCAGATTTCCAGTGCTTCCAGCAAGCCCGAGCCGTGGGGCTGTCGGGCACCTTCCGGGCTTTCCTGTCCTCTAGGCTGCAGGATCTCTATAGCATCGTGCGCCGTGCTGACCGGGGGTCTGTGCCCATCGTCAACCTGAAGGACGAGGTGCTATCTCCCAGCTGGGACTCCCTGTTTTCTGGCTCCCAGGGTCAACTGCAACCCGGGGCCCGCATCTTTTCTTTTGACGGCAGAGATGTCCTGAGACACCCAGCCTGGCCGCAGAAGAGCGTATGGCACGGCTCGGACCCCAGTGGGCGGAGGCTGATGGAGAGTTACTGTGAGACATGGCGAACTGAAACTACTGGGGCTACAGGTCAGGCCTCCTCCCTGCTGTCAGGCAGGCTCCTGGAACAGAAAGCTGCGAGCTGCCACAACAGCTACATCGTCCTGTGCATTGAGAATAGCTTCATGACCTCTTTCTCCAAA。SEQIDNo.2：ATGTCGAATAACGCTTTACAAACAATTATTAACGCCCGGTTACCAGGCGAAGAGGGGCTGTGGCAGATTCATCTGCAGGACGGAAAAATCAGCGCCATTGATGCGCAA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种携带ES/CD基因、具有肿瘤归巢性的靶向探针，由如下方法获得：(1)合成内皮抑素(Endostatin)和自杀基因(CD)的融合基因重组慢病毒，将该慢病毒转染内皮祖细胞(EPC)，形成ES/CD‑EPC；(2)在超顺磁性纳米颗粒四氧化三铁表面进行PEG修饰，并引入anti‑AFP和anti‑CD34抗体，形成复合物SPIO‑PEG‑BsAb；(3)步骤(1)ES/CD‑EPC和步骤(2)SPIO‑PEG‑BsAb结合，得到SPIO‑PEG‑BsAb‑ES/CD‑EPC，即所述靶向探针。

【技术特征摘要】
1.一种携带ES/CD基因、具有肿瘤归巢性的靶向探针，由如下方法获得：(1)合成内皮抑素(Endostatin)和自杀基因(CD)的融合基因重组慢病毒，将该慢病毒转染内皮祖细胞(EPC)，形成ES/CD-EPC；(2)在超顺磁性纳米颗粒四氧化三铁表面进行PEG修饰，并引入anti-AFP和anti-CD34抗体，形成复合物SPIO-PEG-BsAb；(3)步骤(1)ES/CD-EPC和步骤(2)SPIO-PEG-BsAb结合，得到SPIO-PEG-BsAb-ES/CD-EPC，即所述靶向探针。2.如权利要求1所述的靶向探针，其特征在于所述内皮抑素基因序列如SEQIDNo.1所示，所述自杀基因序列如SEQIDNo.2所示。3.制备如权利要求1所述靶向探针的方法，其特征在于所述方法如下：(1)用PCR方法得到ATG+ES+T2A+CD+taa目的基因片段，克隆到载体LV5中，连接...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙军辉，周官辉，艾静，周坦洋，朱统寅，吴李鸣，张岳林，陈新华，周民，任志刚，凌代舜，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33