一种猪肺炎支原体抗原浓缩纯化的方法技术

本发明专利技术针对猪肺炎支原体抗原杂蛋白去除率和抗原回收率不理想，同时存在外源病毒抗体和免疫原性较差等技术问题，提供一种可以解决现有技术缺陷的猪肺炎支原体抗原浓缩纯化的方法。一种猪肺炎支原体抗原浓缩纯化的方法，包括以下步骤：(1)将猪肺炎支原体抗原培养液进行超滤浓缩，(2)将步骤(1)得到的超滤浓缩液进行洗滤；步骤(1)中超滤浓缩采用中空纤维膜过滤系统，中空纤维膜孔径为750KD或0.1μm，超滤浓缩剪切速率为2000～6000sec‑1、跨膜压为0～10psi；步骤(2)中洗滤采用等体积动态平衡洗滤(即加入洗滤液的速率与透过端流出液的速率相同)，洗滤液为不含血清的猪肺炎支原体培养基基础液。

A Method for Concentration and Purification of Mycoplasma Pneumoniae Antigen

【技术实现步骤摘要】
一种猪肺炎支原体抗原浓缩纯化的方法
本专利技术涉及抗原纯化
，具体地说，本专利技术涉及一种猪肺炎支原体抗原浓缩纯化的方法。
技术介绍
猪支原体肺炎(Mycoplasmalpneumoniaofswine)是由猪肺炎支原体引起的一种慢性、接触性、呼吸道传染病，又称猪地方流行性肺炎、猪霉形体肺炎，我国俗称猪气喘病，主要临诊症状是咳嗽和气喘，剖检变化为肺的尖叶、心叶和膈叶呈典型的“肉样”或“虾肉样”对称性实变。该病发病率高，死亡率低，普遍存在于世界各地，我国部分省市规模化养猪场血清学检验，阳性率30％～50％。该病多呈慢性经过，常有其他病菌继发感染，如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌等。长期以来，本病一直被认为是对养猪业造成重大经济损失，最常发生、流行最广、最难净化的重要疫病之一。动物疫病防控事关养殖业生产安全、动物源性食品安全、公共卫生安全和生态安全。疫苗在疾病预防中的地位日益重要，对疫苗质量的要求也日益提高。近年来，动物疫苗工艺上游技术已趋向多样性技术，如基因工程，新基因突变筛选等，下游工艺改革升级也在迅速崛起。在传统和新型疫苗的制备中，应用先进的分离纯化技术是提高疫苗效力、降低副反应的有效手段。疫苗纯化过程中常使用的方法有超速离心、聚乙二醇或硫酸铵沉淀、超滤、层析等。传统的离心、过滤和沉淀技术目前更多的是作为整个疫苗分离纯化工艺的起始步骤，用于初步的分离；膜分离和超速离心纯化技术在疫苗纯化过程中有着广阔的发展前景，用该工艺制备的疫苗，纯度和性状符合规程要求，但抗原回收率相对较低、操作繁琐且周期长。近年来，行业内有采用超滤浓缩配合洗滤的方法纯化猪肺炎支原体抗原，该方法操作简单且周期短，但杂蛋白去除率、抗原回收率较仍不理想，同时，存在外源病毒抗体，影响联苗的免疫效力，而且免疫原性较差，进而影响疫苗品质。
技术实现思路
本专利技术旨在针对猪肺炎支原体抗原杂蛋白去除率和抗原回收率不理想，同时存在外源病毒抗体和免疫原性较差等技术问题，提供一种可以解决现有技术缺陷的猪肺炎支原体抗原浓缩纯化的方法。为解决纯化过程中出现的以上问题，本专利技术采用以下技术方案：一种猪肺炎支原体抗原浓缩纯化的方法，包括以下步骤：(1)将猪肺炎支原体抗原培养液进行超滤浓缩，(2)将步骤(1)得到的超滤浓缩液进行洗滤；步骤(1)中所述超滤浓缩采用中空纤维膜过滤系统，中空纤维膜孔径为750KD或0.1μm，所述超滤浓缩剪切速率为2000～6000sec-1、跨膜压为0～10psi；步骤(2)中所述洗滤采用等体积动态平衡洗滤(即加入洗滤液的速率与透过端流出液的速率相同)，洗滤液为不含血清的猪肺炎支原体培养基基础液；所述猪肺炎支原体培养基基础液由以下方法制得，称取脑心浸粉5g，PPLO肉汤粉6g，酵母提取物10g，Hanks液500ml，去离子水定容至1000ml。进一步的，所述超滤浓缩的倍数为5～20倍。进一步的，所述洗滤的次数为5～10次。进一步的，所述超滤浓缩采用的中空纤维膜孔径为0.1μm，剪切速率为4000s-1，跨膜压为0～10psi，所述超滤浓缩的倍数为10倍；所述洗滤的次数为10次。进一步的，所述猪肺炎支原体抗原培养液中含有的抗原是猪肺炎支原体活抗原或猪肺炎支原体灭活抗原。本专利技术方法的杂蛋白去除率最高达到96.85％；抗原回收率最高达到100％；洗滤液中PCV2抗体、蓝耳病毒抗体均呈阴性，避免了原有血清中抗体对PCV2和猪繁殖与呼吸综合征病毒的中和；分别将纯化前后的猪肺炎支原体抗原灭活，并免疫兔子，纯化前后兔子产生的猪肺炎支原体抗体水平相当，最高达到1:160，证明纯化过程对猪肺炎支原体免疫原性无影响；因此，本专利技术方法对于降低猪肺炎支原体相关疫苗产品副反应、提升相关疫苗产品质量具有重要意义。附图说明图1为猪肺炎支原体灭活抗原纯化前及纯化过程中洗滤液SDS-PAGE；其中，泳道M：Marker，泳道1：支原体原液，泳道2：5倍浓缩液，泳道3：洗滤1次液，泳道4：洗滤2次液，泳道5：洗滤3次液，泳道6：洗滤5次液，泳道7：洗滤6次液，泳道8：洗滤7次液。具体实施方式为了更好地理解本技术方案，以下对本专利技术的具体实施方式进行详细描述。实施例中所描述的具体数据、参数、操作步骤及结果仅用于说明本专利技术，而不应当限制权力要求中所描述的本专利技术。实施例1猪肺炎支原体抗原的制备向发酵罐内加入发酵罐体积70％的猪肺炎支原体培养基基础液(以下猪肺炎支原体培养基基础液简称Friis基础液)，116℃高压灭菌30分钟，自然冷却后，37℃维持1天，无异常后向罐内无菌加入终浓度为20％的猪血清、500U/ml的青霉素、5％的猪肺炎支原体种子液，37℃培养2～4天，待培养液pH下降至6.7～6.8时收获菌液。猪肺炎支原体培养基基础液由以下方法制得，称取脑心浸粉5g，PPLO肉汤粉6g，酵母提取物10g，Hanks液500ml，去离子水定容至1000ml。为了便于操作，并且获得高纯度、高回收的猪肺炎支原体抗原，本实施例中猪肺炎支原体抗原在培养时所用的培养基是经过过滤除菌的，血清是经过56℃灭活且过滤除菌的。实施例2中空纤维膜孔径大小的选择使用300KD、500KD、750KD和0.1μm的中空纤维膜分别对猪肺炎支原体活菌液进行浓缩纯化，剪切速率控制在3000s-1，跨膜压TMP控制在0～10psi，将抗原浓缩至原体积的1/5时，浓缩抗原液用无菌的PBS进行洗滤。具体操作为：向浓缩抗原液中不断匀速加入PBS，保证加入PBS的速率与透过端流出液的速率相同，使之维持一个动态平衡，洗滤开始后待透过端流出液体积和浓缩抗原液体积相同时即洗滤1次，洗滤5次即透过端流出液体积为浓缩抗原液体积的5倍，最后收获的截留液为浓缩纯化的猪肺炎支原体活菌液。每次洗滤液取1ml用于总蛋白含量测定。通过BCA法测定纯化前及各个孔径中空纤维膜浓缩纯化过程中收集液的总蛋白含量，以此计算杂蛋白去除率，结果见表1。猪肺炎支原体活菌液经300KD、500KD、750KD和0.1μm的中空纤维膜浓缩5倍、洗滤5次后杂蛋白去除率分别为63.57％、70.79％、81.27％和86.10％，由此看出750KD和0.1μm的中空纤维膜纯化效果好，蛋白去除率达80％以上。表1猪肺炎支原体活菌液经不同孔径中空纤维膜浓缩纯化过程中总蛋白含量及杂蛋白去除率。实施例3纯化过程中洗滤液的选择使用750KD的中空纤维膜对猪肺炎支原体活菌液进行浓缩纯化，剪切速率控制在3000s-1，跨膜压TMP控制在0～10psi，第一次纯化当抗原浓缩至原体积的1/5时，浓缩抗原液用无菌的PBS动态洗滤5次，浓缩、纯化过程中的透过液和每次洗滤液均取1ml用于CCU测定；第二次纯化当抗原浓缩至原体积的1/5时，浓缩抗原液用无菌的不含猪血清的Friis基础液动态洗滤5次，浓缩、纯化过程中的透过液和每次洗滤液均取1ml用于CCU测定，对比两种洗滤液收集液的CCU，通过CCU来评判浓缩纯化过程中猪肺炎支原体的回收率，结果见表2。从表中可以看出猪肺炎支原体活菌液经750KD的中空纤维膜浓缩5倍后CCU是浓缩前的5倍，且浓缩及纯化过程中透过端没有检测到CCU，但是用PBS洗滤时随着洗滤次数的增加猪肺炎支原体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪肺炎支原体抗原浓缩纯化的方法，包括以下步骤：(1)将猪肺炎支原体抗原培养液进行超滤浓缩，(2)将步骤(1)得到的超滤浓缩液进行洗滤；步骤(1)中所述超滤浓缩采用中空纤维膜过滤系统，中空纤维膜孔径为750KD或0.1μm，所述超滤浓缩剪切速率为2000～6000sec‑1、跨膜压为0～10psi；步骤(2)中所述洗滤采用等体积动态平衡洗滤，洗滤液为不含血清的猪肺炎支原体培养基基础液；所述猪肺炎支原体培养基基础液由以下方法制得，称取脑心浸粉5g，PPLO肉汤粉6g，酵母提取物10g，Hanks液500ml，去离子水定容至1000ml。

【技术特征摘要】
1.一种猪肺炎支原体抗原浓缩纯化的方法，包括以下步骤：(1)将猪肺炎支原体抗原培养液进行超滤浓缩，(2)将步骤(1)得到的超滤浓缩液进行洗滤；步骤(1)中所述超滤浓缩采用中空纤维膜过滤系统，中空纤维膜孔径为750KD或0.1μm，所述超滤浓缩剪切速率为2000～6000sec-1、跨膜压为0～10psi；步骤(2)中所述洗滤采用等体积动态平衡洗滤，洗滤液为不含血清的猪肺炎支原体培养基基础液；所述猪肺炎支原体培养基基础液由以下方法制得，称取脑心浸粉5g，PPLO肉汤粉6g，酵母提取物10g，Hanks液500ml，去离子水定容至1000ml。2.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：车巧林，肖澄，郁伟军，徐凤，董彦鹏，缪芬芳，耿晓眉，余姣，胡静雅，
申请(专利权)人：江苏南农高科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32