高光谱干涉非标记成像方法及活细胞定量断层成像系统技术方案

本发明专利技术涉及高光谱干涉非标记成像方法及活细胞定量断层成像系统，该成像系统包括光源，光源发出的光准直成平行光后入射到第一分束镜；经第一分束镜透射的光通过物镜会聚到细胞培养箱内的活细胞样品上，经活细胞反射或散射的光被物镜准直成平行光返回第一分束镜，经第一分束镜反射后垂直发射到成像透镜，经成像透镜出射的光通过第二分束镜；光谱仪接收经第二分束镜透射后在成像透镜焦点上的单个像素的干涉高光谱信息发送到计算机；计算机控制电动平移台完成细胞样品的对焦，且计算机对所有像素点的干涉高光谱信号进行处理，得到活细胞的定量断层成像结果，然后将所有断层图像进行拼接组合，重建出活细胞的三维立体结构图像。

Hyperspectral interference labeled imaging method and quantitative tomography system for living cells

【技术实现步骤摘要】
高光谱干涉非标记成像方法及活细胞定量断层成像系统
本专利技术是关于一种高光谱干涉非标记成像方法及活细胞定量断层成像系统，涉及活细胞成像

技术介绍
长时间细胞层析成像是生物医学研究和临床诊断中不可或缺的工具。活细胞有效、持续的断层扫描能够揭示微观尺度上的天然、动态、亚细胞水平的变化，对于掌握长时程细胞形态学信息和代谢情况至关重要。为了实现有效和连续细胞成像，超分辨率的荧光显微镜已成为亟需的成像手段。然而，使用荧光成像仪器，光毒性和光漂白是不可避免的问题。这两种现象限制了荧光显微镜的活细胞长时间稳定成像应用。而且，将荧光基团导入活细胞中的样品制备过程通常非常复杂。由于荧光标记引起的挑战也阻碍了共聚焦显微镜和双光子显微镜的广泛应用。为了解决这个问题，非标记成像技术提供了一种可行的解决方案。其中，相衬成像和微分干涉差分显微镜是两种典型的方法。然而，这两种成像技术都只能提供定性图像，定量的非标记成像技术还有待研究。发展自相衬和微分干涉差分成像技术的定量相位成像是一种非标记成像技术，该技术可以精确量化由样本异质性所引起的相位移动。该方法能够在没有外来标记物的情况下揭示细胞纳米级形态，因此引起了广泛关注。然而，尽管定量相位成像技术已经取得了较为突出的研究进展，但是精确的纳米级成像分辨率仍然是一项具有挑战性的技术瓶颈。对于定量相位成像技术，当入射光的传播需要经过整个景深，这使得相位的移动是由多层光束相干累积而产生的。由于三维点扩散函数的限制，景深范围内不同层的干涉信号均被收集到物镜的孔径中，并在图像平面中相互叠加。干涉信号的相位无法解析映射到不同的样品层上，使得活细胞样品不同层的图像无法区分，轴向分辨率差。对于厚的样品，比如卵细胞样品或是散射较为明显的样品，不同层的干涉信号叠加之后，其相位信息甚至会变得较为模糊。综上，尽管干涉现象能够提供亚纳米级的分辨率，但是目前的定量相位成像技术不能提供纳米级的轴向分辨率。通常定量相位成像仪器的轴向分辨率大于1μm，这会严重制约重建结果的质量。此外，常见的定量相位成像仪器使用相衬或微分干涉差分显微镜的光路结构来生成相干信号，并利用空间光调制器或液晶滤色片来调制相位或波长，这些组件都非常昂贵，需要精密操作，限制了定量相位成像技术的实际应用。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种轴向分辨率高且能够分层定量成像的高光谱白光干涉非标记成像方法及活细泡定量断层成像系统。为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种高光谱干涉非标记成像方法，包括以下内容：S1：将待测活细胞样品置于基底上，入射到活细胞样品的光被细胞膜反射、被细胞内部的细胞器和生物大分子散射、然后被基底反射，其中：振幅为U(λ)的光束垂直照射到活细胞上，活细胞在细胞膜处的反射信号为：式中，λ为波长，U1为细胞膜的反射光，n0和n1均为细胞培养液的折射率和基底折射率；细胞内的散射信号为：式中，λ0为光的中心波长,i为虚数常量，z是空间高度位置坐标，nΔ是活细胞内部折射率变化分布函数；基底的反射信号为：式中，D为细胞膜到基底表面的厚度；多层干涉信号I(λ)的强度等于：I(λ)＝|U1(λ)+U2(λ)+U3(λ)|2(4)忽略活细胞内部不同细胞器内膜层之间微小的互相干信号，活细胞的多层干涉光谱反射率表示为：S2：将多层干涉光谱信息除以照明光谱，得到干涉高光谱信号，将干涉高光谱信号作沿波数维度的均匀采样；S3：采集标准硅片的干涉高光谱经傅立叶变换后，确定基底的氧化层厚度对应频率的幅值在不同失焦情况下的幅值衰减，将此作为矫正系数，实际样品不同层的幅值除以矫正系数，以完成校准处理；S4：对每个干涉高光谱信号进行傅立叶变换，所得到的傅立叶变换结果的最大峰值横坐标除以4πn1即细胞膜厚度，各个傅立叶变换结果的幅值根据公式(5)可转换为nΔ(z)，进而求得每个断层对应的折射率数值；S5：按照活细胞三维空间上的相对位置关系，使得傅立叶变换后的每个频率与细胞结构的一层相对应，得到活细胞断层折射率分布的定量信息图像，并将所有断层折射率分布的定量信息图像进行拼接组合，重建出活细胞的三维立体结构。进一步地，基底采用高反射率基底，所述高反射率基底采用硅基材料、二氧化硅基材料、金属材料、非金属材料、化合物、高分子材料聚合物中的一种。进一步地，待测活细胞为动植物细胞、病毒、微生物、模式生物、细胞囊泡或细胞碎片。第二方面，本专利技术还提供一种活细泡定量断层成像系统，该成像系统包括光源、光学显微成像系统、细胞培养箱、电动平移台、光谱仪和计算机；所述光学显微成像系统包括聚光准直镜、第一分束镜、第二分束镜、物镜和成像透镜，所述光谱仪的输入端设置在所述成像透镜焦点处，所述光谱仪的输出端连接所述计算机；所述细胞培养箱固定设置在所述电动平移台上部；所述光源发出的光经所述聚光准直镜准直成平行光后入射到所述第一分束镜；经所述第一分束镜透射的光通过所述物镜会聚到所述细胞培养箱内的活细胞样品上，经活细胞反射或散射的光被所述物镜准直成平行光后，沿原光路返回所述第一分束镜，经所述第一分束镜反射后垂直发射到成像透镜，经所述成像透镜出射的光通过所述第二分束镜；所述光谱仪接收经所述第二分束镜透射后，被所述成像透镜汇聚在焦点上的单个像素的干涉高光谱信息，并发送到计算机；所述计算机控制所述电动平移台完成细胞样品的对焦，且所述计算机获得焦平面所有像素点的干涉高光谱信息，对所有像素点的干涉高光谱信号进行处理，得到活细胞的定量断层成像结果，并通过调整所述电动平移台逐层获得活细胞的定量断层成像，然后将所有断层图像通过进一步的拼接组合，重建出活细胞的三维立体结构。进一步地，该成像系统还包括相机，所述相机采集经所述第二分束镜反射的宽场显微成像图像发送到所述计算机，所述计算机通过判断图像清晰度，并控制所述电动平移台的运动进行Z向调焦反馈控制，实现对细胞样品进行对焦，然后完成对活细胞的扫描。进一步地，所述计算机内设置有电动平移台控制单元、记录单元和计算单元；所述电动平移台控制单元用于控制电动平移台移动到测量采样点；所述记录单元用于采集每一测量采样点的光谱数据；所述计算单元用于将每个测量采样点的光谱与照明光谱相除，并将干涉高光谱做均匀采样和傅立叶变换，得到每个像素点在不同断层处的折射率数值，直至整个活细胞扫描完毕，按照活细胞三维空间上的相对位置关系，得到活细胞断层折射率分布的定量信息，完成长时程的活细胞定量断层成像。进一步地，所述细胞培养箱包括箱体本体、ITO玻璃、加热膜、加湿盒和载物台；所述箱体内设置有所述载物台，所述载物台顶部通过弹簧片压设所述ITO玻璃；所述箱体内设置有加热膜，通过所述计算机根据温湿度对所述加热膜反馈控制，使所述箱体保持所需温度；所述箱体内设置有加湿盒，所述加热膜对所述加湿盒内部的水加热，以保障所述箱体内的相对湿度足够培养细胞；所述箱体还设置有进水口、二氧化碳入口、电气连接口、培养液进口和培养液出口，所述进水口用于对所述加湿盒加水，所述二氧化碳入口用于向所述箱体内通入二氧化碳，所述电气连接接口用于将加热膜、温湿度传感器、二氧化碳传感器连接计算机，所述培养液出口用于抽取已经使用过的培养废液，所述培养液进口用于通入新鲜培养液体。进一步地，该成像系统还包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高光谱干涉非标记成像方法，其特征在于包括以下内容：S1：将待测活细胞样品置于基底上，入射到活细胞样品的光被细胞膜反射、被细胞内部的细胞器和生物大分子散射、然后被基底反射，其中：振幅为U(λ)的光束垂直照射到活细胞上，活细胞在细胞膜处的反射信号为：

【技术特征摘要】
1.一种高光谱干涉非标记成像方法，其特征在于包括以下内容：S1：将待测活细胞样品置于基底上，入射到活细胞样品的光被细胞膜反射、被细胞内部的细胞器和生物大分子散射、然后被基底反射，其中：振幅为U(λ)的光束垂直照射到活细胞上，活细胞在细胞膜处的反射信号为：式中，λ为波长，U1为细胞膜的反射光，n0和n1均为细胞培养液的折射率和基底折射率；细胞内的散射信号为：式中，λ0为光的中心波长,i为虚数常量，z是空间高度位置坐标，nΔ是活细胞内部折射率变化分布函数；基底的反射信号为：式中，D为细胞膜到基底表面的厚度；多层干涉信号I(λ)的强度等于：I(λ)＝|U1(λ)+U2(λ)+U3(λ)|2(4)忽略活细胞内部不同细胞器内膜层之间微小的互相干信号，活细胞的多层干涉光谱反射率表示为：S2：将多层干涉光谱信息除以照明光谱，得到干涉高光谱信号，将干涉高光谱信号作沿波数维度的均匀采样；S3：采集标准硅片的干涉高光谱经傅立叶变换后，确定基底的氧化层厚度对应频率的幅值在不同失焦情况下的幅值衰减，将此作为矫正系数，实际样品不同层的幅值除以矫正系数，以完成校准处理；S4：对每个干涉高光谱信号进行傅立叶变换，所得到的傅立叶变换结果的最大峰值横坐标除以4πn1即细胞膜厚度，各个傅立叶变换结果的幅值根据公式(5)可转换为nΔ(z)，进而求得每个断层对应的折射率数值；S5：按照活细胞三维空间上的相对位置关系，使得傅立叶变换后的每个频率与细胞结构的一层相对应，得到活细胞断层折射率分布的定量信息图像，并将所有断层折射率分布的定量信息图像进行拼接组合，重建出活细胞的三维立体结构。2.根据权利要求1所述的高光谱白光干涉非标记成像方法，其特征在于，基底采用高反射率基底，所述高反射率基底采用硅基材料、二氧化硅基材料、金属材料、非金属材料、化合物、高分子材料聚合物中的一种。3.根据权利要求1或2所述的高光谱白光干涉非标记成像方法，其特征在于，待测活细胞为动植物细胞、病毒、微生物、模式生物、细胞囊泡或细胞碎片。4.一种实现如权利要求1到3任一项所述的高光谱白光干涉非标记成像方法的活细泡定量断层成像系统，其特征在于，该成像系统包括光源、光学显微成像系统、细胞培养箱、电动平移台、光谱仪和计算机；所述光学显微成像系统包括聚光准直镜、第一分束镜、第二分束镜、物镜和成像透镜，所述光谱仪的输入端设置在所述成像透镜焦点处，所述光谱仪的输出端连接所述计算机；所述细胞培养箱固定设置在所述电动平移台上部；所述光源发出的光经所述聚光准直镜准直成平行光后入射到所述第一分束镜；经所述第一分束镜透射的光通过所述物镜会聚到所述细胞培养箱内的活细胞样品上，经活细胞反射或散射的光被所述物镜准直成平行光后，沿原光路返回所述第一分束镜，经所述第一分束镜反射后垂直发射到成像透镜，经所述成像透镜出射的光通过所述第二分束镜；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄国亮，符荣鑫，苏雅，靳翔宇，杨晗，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11