一种检测ATP7B基因常见突变的试剂盒及基因芯片制造技术

本发明专利技术公开一种检测ATP7B基因常见突变的试剂盒及基因芯片，涉及生物检测鉴定领域。所述试剂盒包括用于检测ATP7B基因的28个常见突变位点的探针，以及针对所述常见突变位点的多重不对称PCR引物对；所述基因芯片，包括如上所述的引物和探针，所述探针固定在固相载体上。本发明专利技术可简单快速检测中国人群ATP7B基因的28个常见突变位点，进行较高通量的人群突变检测。

A Kit and Gene Chip for Detecting Common Mutations of ATP7B Gene

【技术实现步骤摘要】
一种检测ATP7B基因常见突变的试剂盒及基因芯片
本专利技术涉及生物检测鉴定领域，更具体地，涉及一种检测ATP7B基因常见突变的试剂盒及基因芯片。
技术介绍
肝豆状核变性(Hepatolenticulardegeneration，HLD)，即Wilsondisease(WD)，是一种由ATP7B基因突变导致的常染色体隐性遗传的铜代谢障碍性疾病，ATP7B基因突变所致的铜离子大量沉积是其重要的致病因素，因此早期诊断和驱铜治疗对于患者的预后具有重要意义。目前，基于Sanger测序的ATP7B基因突变检测已成为肝豆状核变性分子诊断的重要参考指标。目前，针对ATP7B基因上的突变绝大多数仍采用一代测序的经典方法。该方法虽能够提供精确的检测结果，但由于ATP7B基因较大且拥有21个外显子，使得操作较为繁琐且测序周期较长，若同时对多个病人进行检测则需花费较多的人力及时间成本，不适用于快速的临床诊断筛查。此外，尽管单引物扩增、GoldenGateTM和分子倒置探针等技术都可以在高通量水平对基因突变位点进行检测，但这些技术均对靶序列要求较高，不能随意地分型所选择的基因位点，因而难以应用于临床检测诊断。基因芯片属于生物芯片的一种，其将大量预先制备的寡核苷酸探针有序地固化于醛基基片表面，然后与标记的样品进行杂交，通过计算机对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息。目前，基因芯片技术已逐渐应用于基因的功能研究和基因组研究、疾病的临床诊断和检测等众多方面。而疾病诊断基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，具有高度的灵敏性和准确性，且快速简便，可同时检测多种疾病等优点。目前，国内的基因芯片研究在分子诊断领域并未得到广泛的应用，更未有针对肝豆状核变性ATP7B基因的临床突变检测芯片的研发及报道。2008年，曾有一款针对捷克斯洛伐克人群的肝豆状核变性ATP7B基因突变检测芯片问世，但此款芯片基于微阵列引物扩增反应技术(arrayedprimerextensionreaction，APEX)，需要针对每个突变位点设计特异的延伸引物，操作难度较大，不利于临床推广应用。此外，该芯片所检测的突变多为捷克人群中的热点突变，与我国患者的突变谱相差较大，在我国并不具有引进及应用的价值。因此，本专利技术设计并研发了一种用于中国人群ATP7B基因常见突变位点检测的寡核苷酸探针基因芯片，将ATP7B基因野生型或包含突变碱基的寡核苷酸探针固定在芯片的每个预先设置的反应区域内，将患者血液样本DNA经多重不对称PCR扩增并进行荧光标记后与芯片探针进行杂交，通过检测杂交信号并进行计算机分析，从而检测特定位点的突变情况。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一组检测ATP7B基因常见突变的引物和探针，可简单快速检测中国人群ATP7B基因的28个常见突变位点。本专利技术的第二个目的在于提供一种检测ATP7B基因常见突变的试剂盒。本专利技术的第三个目的在于提供一种检测ATP7B基因常见突变的基因芯片，选取中国人群中最常见的28个致病性突变位点为检测靶标，可进行较高通量的人群突变检测。为达到上述第一个目的，本专利技术采用下述技术方案：一组检测ATP7B基因常见突变的引物和探针，包括用于检测ATP7B基因的28种常见突变的探针，以及针对所述常见突变位点的多重不对称PCR引物对；所述探针的序列如SEQIDNO：27至SEQIDNO：134所示；所述多重不对称PCR引物对的序列如SEQIDNO：1至SEQIDNO：26所示。优选地，每对多重不对称PCR引物对均包括正向引物和反向引物，反向引物的5'端进行Cy3荧光标记。优选地，每条探针的3'端均包括如EQIDNO：136所述的序列，并加入氨基基团修饰。优选地，所述多重不对称PCR引物对分为三组分别进行多重不对称PCR反应；其中，反应1包括如SEQIDNO：1至SEQIDNO：8所示的序列，反应2包括如SEQIDNO：9至SEQIDNO：16所示的序列，反应3包括如SEQIDNO：17至SEQIDNO：26所示的序列。本专利技术还提供如上任一项所述的引物和探针在制备检测ATP7B基因突变产品中的应用。为达到上述第二个目的，本专利技术采用下述技术方案：一种检测ATP7B基因常见突变的试剂盒，包括如上任一项所述的引物和探针。优选地，所述试剂盒还包括完成多重不对称PCR反应所需的PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和DEPC水。优选地，所述试剂盒还包括定位探针和阴性对照；所述定位探针的序列如SEQIDNO：135所示，且其3'端进行氨基基团修饰，5'端进行Cy3修饰。为达到上述第三个目的，本专利技术采用下述技术方案：一种检测ATP7B基因常见突变的基因芯片，包括如上任一项所述的引物和探针，所述探针固定在固相载体上。优选地，所述固相载体为晶芯光学级醛基基片。本专利技术的有益效果如下：本专利技术提供的一组检测ATP7B基因常见突变的引物和探针，所选取的突变位点涵盖了中国人群ATP7B基因上28个常见突变位点，根据公共数据库、国内外文献及本院所收集的肝豆状核变性患者资料，本芯片的临床患者覆盖度可达85％，因此十分适用于大样本的临床肝豆状核变性患者的快速诊断筛查。本专利技术利用13对Cy3荧光标记引物扩增病人DNA，可通过三次多重不对称PCR反应得到全部的检测位点序列，在保证后续反应所需样本量的同时完成标记，省时并降低了实验成本。且Cy3荧光染料标记，洗片后可直接荧光扫描仪观察结果，无需显色，根据探针杂交信号的强弱，可判定被测位点基因型。本专利技术还提供一种包括上述引物和探针的基因芯片，通过多重不对称PCR反应，每张芯片可同时检测多位病人的样本，8-10小时内即可获得检测结果，相比于一代测序(3-4天)可节省大量的时间，且通量高，实验操作简单。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1示出本专利技术多重不对称PCR产物的3％琼脂糖凝胶电泳图。(反应1泳道的条带从上到下依次为287bp，250bp，172bp，137bp；反应2泳道的条带从上到下依次为248bp，212bp，166bp，130bp；反应3泳道的条带从上到下依次为260bp，226bp，196bp，163bp，84bp)图2示出本专利技术基因芯片点样布控示意图。图3示出本专利技术实施例3中健康志愿者ATP7B基因突变(均为野生型位点)基因芯片检测图。图4示出本专利技术实施例3中肝豆状核变性患者ATP7B基因突变(均为突变型位点)基因芯片检测图。具体实施方式为了更清楚地说明本专利技术，下面结合优选实施例和附图对本专利技术做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本专利技术的保护范围。一方面，本专利技术首先提供了一组检测ATP7B基因常见突变的引物和探针，包括用于检测ATP7B基因的28种常见突变的探针，以及针对所述常见突变位点的多重不对称PCR引物对；所述探针的序列如SEQIDNO：27至SEQIDNO：134所示；所述多重不对称PCR引物对的序列如SEQIDNO：1至SEQIDNO：26所示。其中，引物序列见表1，探针序列见表2。本专利技术依据申请人课题组的自有研究结果，并收集公开发表的中国人群ATP7B基因突变信息，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组检测ATP7B基因常见突变的引物和探针，其特征在于，包括用于检测ATP7B基因的28种常见突变的探针，以及针对所述常见突变位点的多重不对称PCR引物对；所述探针的序列如SEQ ID NO：27至SEQ ID NO：134所示；所述多重不对称PCR引物对的序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：26所示。

【技术特征摘要】
1.一组检测ATP7B基因常见突变的引物和探针，其特征在于，包括用于检测ATP7B基因的28种常见突变的探针，以及针对所述常见突变位点的多重不对称PCR引物对；所述探针的序列如SEQIDNO：27至SEQIDNO：134所示；所述多重不对称PCR引物对的序列如SEQIDNO：1至SEQIDNO：26所示。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，每对多重不对称PCR引物对均包括正向引物和反向引物，反向引物的5'端进行Cy3荧光标记。3.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，每条探针的3'端均包括如EQIDNO：136所述的序列，并加入氨基基团修饰。4.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述多重不对称PCR引物对分为三组分别进行多重不对称PCR反应；其中，反应1包括如SEQIDNO：1至SEQIDNO：8所示的序列，反应2包括如SEQIDNO：9至SEQIDNO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄坚，周冬虎，贾思雨，李潇瑾，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京友谊医院，
类型：发明
国别省市：北京,11