本发明专利技术公开了一种促进干细胞扩增及干性维持的胶原材料及其制备方法。本发明专利技术首先提供了一种胶原材料的制备方法，包括如下步骤：(1)取牛筋膜组织，去除表面的肌肉和脂肪，用水清洗；(2)置于含磷酸三丁酯的液体中浸泡；(3)置于水中浸泡并清洗；(4)置于NaCl溶液中浸泡；(5)置于水中浸泡并清洗；(6)置于表面活性剂溶液中浸泡；(7)置于水中浸泡并清洗；(8)置于NaOH溶液中浸泡；(9)置于水中浸泡并清洗；(10)进行冷冻干燥；(11)溶于醋酸溶液；(12)透析；(13)进行冷冻干燥，得到胶原材料。本发明专利技术还保护以上胶原材料在培养干细胞中的应用。本发明专利技术提供的胶原材料对于干细胞培养具有重大的应用推广价值。
A collagen material for promoting stem cell expansion and dry maintenance and its preparation method
【技术实现步骤摘要】
一种促进干细胞扩增及干性维持的胶原材料及其制备方法
本专利技术涉及一种促进干细胞扩增及干性维持的胶原材料及其制备方法。
技术介绍
外源干细胞移植是组织损伤修复的重要手段，干细胞具有自我更新和分化能力，可以分化为特定类型的组织细胞，促进组织再生，同时干细胞也可以通过旁分泌作用改善损伤微环境，促进损伤修复。但是干细胞在体外扩增培养过程中，随着细胞增殖分裂时间的延长，细胞的干性会逐渐降低。因此，如何建立一种能促进干细胞扩增且保持扩增后干细胞特性的培养方法对组织损伤修复至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种促进干细胞扩增及干性维持的胶原材料及其制备方法。本专利技术首先提供了一种胶原材料的制备方法，包括如下步骤：(1)取牛筋膜组织，去除表面的肌肉和脂肪，用水清洗；(2)取完成步骤(1)的组织，置于含磷酸三丁酯的液体中浸泡；(3)取完成步骤(2)的组织，置于水中浸泡并清洗；(4)取完成步骤(3)的组织，置于NaCl溶液中浸泡；(5)取完成步骤(4)的组织，置于水中浸泡并清洗；(6)取完成步骤(5)的组织，置于表面活性剂溶液中浸泡；(7)取完成步骤(6)的组织，置于水中浸泡并清洗；(8)取完成步骤(7)的组织，置于NaOH溶液中浸泡；(9)取完成步骤(8)的组织，置于水中浸泡并清洗；(10)取完成步骤(9)的组织，进行冷冻干燥，得到干燥组织；(11)取步骤(10)得到的干燥组织，溶于醋酸溶液，然后将体系pH调至6-8；(12)将完成步骤(11)的整个体系转移到透析袋在水中进行透析；(13)完成步骤(12)后，收集透析袋内的整个体系，然后进行冷冻干燥，得到干粉，即为干粉状胶原材料。步骤(1)中，所述水为去离子水。步骤(2)中，含磷酸三丁酯的液体是将磷酸三丁酯和水混合得到的。步骤(2)中，磷酸三丁酯的浓度可为0.5g/100ml-1.5g/100ml，具体可为1g/100ml。步骤(2)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(2)中，浸泡的时间可为18小时-72小时，具体可为48小时。步骤(3)中，所述水为去离子水。步骤(3)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(3)中，浸泡并清洗可为“每5分钟-15分钟换水，共换水10次-20次”，具体可为“每10分钟换水，共换水15次，最后一次换水10分钟后完成本步骤”。步骤(4)中，NaCl溶液是将NaCl溶于pH7.6、25mmol/L的Tris-HCl缓冲液得到的。步骤(4)中，NaCl的浓度可为1M-2M，具体可为1.5M。步骤(4)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(4)中，浸泡的时间为10分钟-60分钟，具体可为40分钟。步骤(5)中，所述水为去离子水。步骤(5)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(5)中，浸泡并清洗可为“每5分钟-15分钟换水，共换水8次-20次”，具体可为“每10分钟换水，共换水9次，最后一次换水10分钟后完成本步骤”。步骤(6)中，表面活性剂溶液为表面活性剂水溶液。步骤(6)中，表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度可为1％-5％(体积比)，具体可为3％(体积比)。步骤(6)中，表面活性剂可为Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81、Tween-85、Triton-100、Triton-114等。步骤(6)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(6)中，浸泡的时间为30分钟-120分钟，具体可为80分钟。步骤(7)中，所述水为去离子水。步骤(7)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(7)中，浸泡并清洗可为“每15分钟-25分钟换水，共换水15次-25次”，具体可为“每20分钟换水，共换水19次，最后一次换水20分钟后完成本步骤”。步骤(8)中，NaOH溶液为NaOH水溶液。步骤(8)中，NaOH溶液中，NaOH的浓度可为0.5M-4M，具体可为2M。步骤(8)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(8)中，浸泡的时间为10分钟-60分钟，具体可为30分钟。步骤(9)中，所述水为去离子水。步骤(9)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(9)中，浸泡并清洗可为“每3分钟-10分钟换水，共换水15次-25次”，具体可为“每5分钟换水，共换水19次，最后一次换水5分钟后完成本步骤”。步骤(10)中，所述冷冻干燥的时间可为24小时-72小时，具体可为48小时。步骤(11)中，所述醋酸溶液为醋酸水溶液。步骤(11)中，醋酸溶液为0.05M-1M醋酸溶液，具体可为0.5M醋酸溶液。步骤(11)中，干燥组织与醋酸溶液的配比为“1g-5g：100ml-500ml”，具体配比可为“1g-5g：150ml”或“3g：100ml-500ml”，具体配比可为“3g：150ml”。步骤(11)中，醋酸溶液为预冷的醋酸溶液。所述预冷的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(11)中，溶于醋酸溶液的实现方式可为“2℃-16℃搅拌2小时-24小时”，具体可为“4℃搅拌12小时”。步骤(11)中，体系pH调至7。步骤(11)中，用NaOH水溶液调pH，具体用4MNaOH水溶液调pH。步骤(12)中，所述透析袋的截留分子量为1000Da-100kDa，具体可为3000Da。步骤(12)中，所述水为去离子水。步骤(12)中，透析的时间可为3天-10天，具体可为7天。步骤(12)中，透析过程中每天换水，具体可每天换水3次。步骤(12)中，透析的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(13)中，所述冷冻干燥的时间可为24小时-72小时，具体可为48小时。所述方法还包括如下步骤(14)：取步骤(13)得到的干粉状胶原材料，用溶剂溶解，得到凝胶状胶原材料。步骤(14)中，溶剂可为生理盐水或磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液可为pH7-8的磷酸盐缓冲液，具体可为pH7.4的PBS缓冲液。步骤(14)中，干粉状胶原材料与溶剂的配比可为“0.2-4g：100ml”，具体可为“3g：100ml”。以上任一所述方法制备得到的干粉状胶原材料也属于本专利技术的保护范围。以上任一所述方法制备得到的凝胶状胶原材料也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还保护以上任一所述干粉状胶原材料或凝胶状胶原材料在制备产品中的应用；所述产品的功能为培养干细胞。本专利技术还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述干粉状胶原材料或凝胶状胶原材料；所述产品的功能为培养干细胞。本专利技术还保护以上任一所述干粉状胶原材料或凝胶状胶原材料在培养干细胞中的应用。本专利技术还保护一种培养干细胞的方法，包括如下步骤：将干细胞与所述凝胶状胶原材料混合，然后进行培养。干细胞与凝胶状胶原材料的配比可为“102-108个细胞：500μl-1000μl凝胶状胶原材料”，具体可为“5×103个-105个细胞：500μl-1000μl凝胶状胶原材料”，更具体可为“5×103个细胞：500μl凝胶状胶原材料”或“105个细胞：1000μl凝胶状胶原材料”。所述培养的时间可为5-7天。所述培养的条件具体可为：37℃、5％CO2、饱和湿度。本专利技术还保护一种培养干细胞的方法，包括如下步骤：将干细胞、所述干粉本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种胶原材料的制备方法，包括如下步骤：(1)取牛筋膜组织，去除表面的肌肉和脂肪，用水清洗；(2)取完成步骤(1)的组织，置于含磷酸三丁酯的液体中浸泡；(3)取完成步骤(2)的组织，置于水中浸泡并清洗；(4)取完成步骤(3)的组织，置于NaCl溶液中浸泡；(5)取完成步骤(4)的组织，置于水中浸泡并清洗；(6)取完成步骤(5)的组织，置于表面活性剂溶液中浸泡；(7)取完成步骤(6)的组织，置于水中浸泡并清洗；(8)取完成步骤(7)的组织，置于NaOH溶液中浸泡；(9)取完成步骤(8)的组织，置于水中浸泡并清洗；(10)取完成步骤(9)的组织，进行冷冻干燥，得到干燥组织；(11)取步骤(10)得到的干燥组织，溶于醋酸溶液，然后将体系pH调至6‑8；(12)将完成步骤(11)的整个体系转移到透析袋在水中进行透析；(13)完成步骤(12)后，收集透析袋内的整个体系，然后进行冷冻干燥，得到干粉，即为干粉状胶原材料。
【技术特征摘要】
1.一种胶原材料的制备方法，包括如下步骤：(1)取牛筋膜组织，去除表面的肌肉和脂肪，用水清洗；(2)取完成步骤(1)的组织，置于含磷酸三丁酯的液体中浸泡；(3)取完成步骤(2)的组织，置于水中浸泡并清洗；(4)取完成步骤(3)的组织，置于NaCl溶液中浸泡；(5)取完成步骤(4)的组织，置于水中浸泡并清洗；(6)取完成步骤(5)的组织，置于表面活性剂溶液中浸泡；(7)取完成步骤(6)的组织，置于水中浸泡并清洗；(8)取完成步骤(7)的组织，置于NaOH溶液中浸泡；(9)取完成步骤(8)的组织，置于水中浸泡并清洗；(10)取完成步骤(9)的组织，进行冷冻干燥，得到干燥组织；(11)取步骤(10)得到的干燥组织，溶于醋酸溶液，然后将体系pH调至6-8；(12)将完成步骤(11)的整个体系转移到透析袋在水中进行透析；(13)完成步...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴建武，赵燕南，陈冰，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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