用于检测眼内液中烟曲霉菌的LAMP引物组合及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测眼内液中烟曲霉菌的LAMP引物组合及应用。本发明专利技术提供的引物组合，由序列1至6所示的6条单链DNA分子组成。本发明专利技术还保护所述引物组合在检测烟曲霉菌中的应用。本发明专利技术还保护检测待测样本是否感染了烟曲霉菌的方法。应用本发明专利技术的LAMP引物及方法，可快速、准确的检测出烟曲霉菌。

LAMP primer combination and application for detection of Aspergillus fumigatus in intraocular fluid

【技术实现步骤摘要】
用于检测眼内液中烟曲霉菌的LAMP引物组合及应用
本专利技术涉及一种用于检测眼内液中烟曲霉菌的LAMP引物组合及应用。
技术介绍
真菌性眼内炎是一种对视力威胁极大的感染性眼部疾病，致盲率高，发病潜伏期长，通常数周甚至数月。早期临床症状不明显，诊断困难，因此，在临床上，尤其发病初期常被误诊而贻误治疗。临床抗真菌药物疗效不足且不良反应较大，真菌对眼部组织破坏性强等原因导致真菌性眼内炎的预后差。近年来，随着术后及慢性炎症大量滥用皮质类固醇激素、抗菌素及免疫制剂，致使人体菌群失调，免疫功能下降，真菌性眼内炎发病率逐年上升。真菌性眼内炎分为内源性眼内炎和外源性眼内炎两种。内源性真菌性眼内炎是由真菌通过血行播散到达眼部引起眼内感染所致，患者通常有长期使用激素、抗生素或免疫抑制剂，或糖尿病、恶性肿瘤、免疫缺陷等病史。最常见的致病真菌为白色念珠菌和曲霉菌。外源性真菌性眼内炎继发于穿通性眼外伤、内眼手术后或真菌性角膜炎，继发于内眼手术后的真菌性眼内炎多由曲霉菌引起。烟曲霉(Aspergillusfunigatus)是一种重要的致病菌，其侵袭力和毒力强，可导致广泛视网膜坏死和脉络膜损害，较其他致病真菌引起的眼内炎预后差。目前临床针对真菌的检测方法主要是分离培养、涂片镜检和血清学诊断。这些检测方法繁琐，检测时间长，阳性率低，且容易发生漏检和错检，无法满足临床快速检测的要求。近几年发展起来的分子检测技术，特别是PCR技术，在微生物快速鉴定和检测方面的应用，为真菌的快速检测开辟了新的途径。但是，PCR存在检测时间长、易污染、假阳性率高的缺点，使其应用受到限制。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术，其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测真菌。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测眼内液中烟曲霉菌的LAMP引物组合及应用。本专利技术提供了引物组合，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB组成；所述引物F3为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物B3为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物FIP为如下(a5)或(a6)：(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物BIP为如下(a7)或(a8)：(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物LF为如下(a9)或(a10)：(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物LB为如下(a11)或(a12)：(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。所述引物组合的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：(b1)鉴定或辅助鉴定待测真菌是否为烟曲霉菌；(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测真菌是否为烟曲霉菌的试剂盒；(b3)检测待测样本是否感染了烟曲霉菌；(b4)制备用于检测待测样本是否感染了烟曲霉菌的试剂盒。本专利技术还保护所述引物组合的应用，如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：(b1)鉴定或辅助鉴定待测真菌是否为烟曲霉菌；(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测真菌是否为烟曲霉菌的试剂盒；(b3)检测待测样本是否感染了烟曲霉菌；(b4)制备用于检测待测样本是否感染了烟曲霉菌的试剂盒。本专利技术还保护含有所述引物对的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)鉴定或辅助鉴定待测真菌是否为烟曲霉菌；(c2)检测待测样本是否感染了烟曲霉菌。本专利技术还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。本专利技术还保护鉴定待测真菌是否为烟曲霉菌方法，包括如下步骤：以待测真菌的基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行LAMP扩增反应，如果采用所述引物组合可以实现以所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测真菌为烟曲霉菌，如果采用所述引物组合不能实现以所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测真菌为非烟曲霉菌。本专利技术还保护鉴定待测真菌是否为烟曲霉菌方法，包括如下步骤：检测待测真菌的基因组DNA中是否存在所述引物组合的靶序列，如果所述基因组DNA中存在所述引物组合的靶序列、待测真菌为烟曲霉菌，如果所述基因组DNA中不存在所述引物组合的靶序列、待测真菌为非烟曲霉菌。本专利技术还保护检测待测样本是否感染了烟曲霉菌的方法，包括如下步骤：以待测样本的总DNA为模板，采用所述引物组合进行LAMP扩增反应，如果采用所述引物组合可以实现以所述总DNA为模板的阳性扩增、待测样本感染了烟曲霉菌，如果采用所述引物组合不能实现以所述总DNA为模板的阳性扩增、待测样本没有感染烟曲霉菌。本专利技术还保护检测待测样本是否感染了烟曲霉菌的方法，包括如下步骤：检测待测样本的总DNA中是否存在所述引物组合的靶序列，如果所述总DNA中存在所述引物组合的靶序列、待测样本感染了烟曲霉菌，如果所述总DNA中不存在所述引物组合的靶序列、待测样本没有感染烟曲霉菌。以上任一所述方法中，具体可通过如下方法判断“阳性扩增”：用荧光PCR仪检测荧光信号，如果出现阳性扩增曲线则为阳性扩增。所述阳性扩增曲线具体可为S型扩增曲线。以上任一所述采用引物组合进行LAMP扩增的反应体系中，引物组合中各条引物的浓度为：0.5μMF3、0.5μMB3、2μMFIP、2μMBIP、1uMLF、1μMLB。以上任一所述采用引物组合进行LAMP扩增的反应体系具体可为：1μL10×ThermoPolBuffer，1.6μL5M甜菜碱，0.1μL50mg/mlBSA，0.4μL100mMMgSO4，0.3μL20×EvaGreen，0.15μL100mMdNTPs，0.4μL8u/mlBstDNA聚合酶大片段，1μL引物混合物(F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的混合物)，模板DNA(50pg-50ng，具体可为2ng)，用ddH2O补足至10μL。以上任一所述LAMP扩增的反应程序具体可为：65℃恒温50min。以上任一所述待测样本具体可为眼部临床样本培养物、眼液体或抽吸物。以上任一所述待测真菌具体可为白色念珠菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌或光滑念珠菌。本专利技术提供了一种用于检测眼内液中烟曲霉菌的LAMP引物组合及应用。本专利技术所述的LAMP引物组合包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP以及环引物LF和LB，可特异性识别靶序列上的六个独立区域进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物组合，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB组成；所述引物F3为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物B3为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物FIP为如下(a5)或(a6)：(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物BIP为如下(a7)或(a8)：(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物LF为如下(a9)或(a10)：(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物LB为如下(a11)或(a12)：(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。...

【技术特征摘要】
1.引物组合，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB组成；所述引物F3为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物B3为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物FIP为如下(a5)或(a6)：(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物BIP为如下(a7)或(a8)：(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物LF为如下(a9)或(a10)：(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物LB为如下(a11)或(a12)：(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。2.权利要求1所述的引物组合的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：(b1)鉴定或辅助鉴定待测真菌是否为烟曲霉菌；(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测真菌是否为烟曲霉菌的试剂盒；(b3)检测待测样本是否感染了烟曲霉菌；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶勇，
申请(专利权)人：北京智德医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11