一种用于鉴定弓形虫的LAMP引物组合及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定弓形虫的LAMP引物组合及其应用。本发明专利技术提供的LAMP引物组合，由序列1至序列6所示的6种DNA分子组成。所述引物组合可应用于鉴定待测寄生虫是否为弓形虫，可应用于检测待测样本是否感染了弓形虫。本发明专利技术提供的引物组合用于鉴定弓形虫，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明专利技术具有重大的推广价值。

A LAMP Primer Combination for Identification of Toxoplasma gondii and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴定弓形虫的LAMP引物组合及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于鉴定弓形虫的LAMP引物组合及其应用。
技术介绍
弓形虫(Toxoplasma)是一种可感染广泛宿主的寄生原虫。眼弓形虫病是由弓形虫感染所致的一种致盲性眼病，是世界范围内引起免疫健全人群感染性脉络膜炎最重要的原因。弓形虫(ToxoplasmaGondii)也叫三尸虫，是细胞内寄生虫。寄生于细胞内，随血液流动，到达全身各部位，破坏大脑、心脏、眼底，致使人的免疫力下降，患各种疾病。它是专性细胞内寄生虫，属于球虫亚纲、真球虫目、等孢子球虫科、弓形体属。目前临床针对弓形虫的检测方法主要是涂片镜检和血清学诊断。这些检测方法繁琐，检测时间长，灵敏度低，容易发生漏检和错检，无法满足快速检测的要求。近几年发展起来的分子检测技术，特别是PCR技术，在微生物快速鉴定和检测方面的应用，为寄生虫的快速检测开辟了新的途径。但是，PCR存在检测时间长、易污染、假阳性率高的缺点，使其应用受到限制。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术，其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测寄生虫。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是鉴定弓形虫或检测被弓形虫感染的样本。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了引物组合，可包括引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB。所述引物F3可为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子。所述引物B3可为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。所述引物FIP可为如下(a5)或(a6)：(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。所述引物BIP可为如下(a7)或(a8)：(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。所述引物LF可为如下(a9)或(a10)：(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。所述引物LB可为如下(a11)或(a12)：(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。所述引物组合具体可由所述引物F3、所述引物B3、所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物LF和所述引物LB组成。所述引物组合中，所述引物F3、所述引物B3、所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物LF和所述引物LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。本专利技术还保护所述引物组合的应用，可为(b1)或(b2)：(b1)鉴定弓形虫；(b2)制备用于鉴定弓形虫的试剂盒。本专利技术还保护所述引物组合的应用，可为(b3)或(b4)：(b3)鉴定待测寄生虫是否为弓形虫；(b4)制备用于鉴定待测寄生虫是否为弓形虫的试剂盒。本专利技术还保护所述引物组合的应用，可为(b5)或(b6)：(b5)检测待测样本是否感染了弓形虫；(b6)制备用于检测待测样本是否感染了弓形虫的试剂盒。本专利技术还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途可为(b1)或(b3)或(b5)：(b1)鉴定弓形虫；(b3)鉴定待测寄生虫是否为弓形虫；(b5)检测待测样本是否感染了弓形虫。所述试剂盒还可含有重组质粒(作为阳性对照)。所述重组质粒可为向pGEM-TEasyVector的限制性内切酶ApaⅠ和SacⅠ之间插入序列表中序列7所示的双链DNA分子得到的。所述试剂盒还可含有灭菌超纯水(作为阴性对照)。本专利技术还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。本专利技术还保护一种鉴定待测寄生虫是否为弓形虫的方法，可包括如下步骤：(1)提取待测寄生虫的基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：如果采用所述引物组合可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测寄生虫为或候选为弓形虫；如果采用所述引物组合不可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测寄生虫不为或候选不为弓形虫。本专利技术还保护一种检测待测样本是否感染了弓形虫的方法，可包括如下步骤：(1)提取待测样本的总DNA；(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，采用所述引物组合进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：如果采用所述引物组合可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本感染了或疑似感染了弓形虫；如果采用所述引物组合不可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本未感染或疑似未感染弓形虫。以上任一所述方法中，环介导等温扩增反应体系(10μL)可为：1μL10×ThermoPolBuffer、1.6μL浓度为5M的甜菜碱、0.1μL浓度为50mg/mL的BSA水溶液、0.4μL浓度为100mM的MgSO4水溶液、0.3μL20×EvaGreen、0.15μL浓度为100mM的dNTPs(每种)、0.4μL浓度为8U/mL的BstDNA聚合酶大片段、模板(约50pg-50ng)、1μL引物混合物，补水至10μL。引物混合物即所述引物F3、所述引物B3、所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物LF和所述引物LB组成的混合物。10×ThermoPolBuffer具体可为Thermo公司的产品。20×EvaGreen具体可为合肥博美生物公司的产品。以上任一所述方法中，所述环介导等温扩增的反应体系中所述引物F3、所述引物B3、所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物LF和所述引物LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。以上任一所述方法中，环介导等温扩增反应条件可为：65℃恒温50min。上述任一所述待测样本可为眼部抽吸物样本(即眼内液)。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术，其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的鉴定弓形虫。LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势。本专利技术提供的引物组合用于鉴定弓形虫，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本专利技术具有重大的推广价值。附图说明图1为特异性的实验结果。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物组合，包括引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB；所述引物F3为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物B3为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物FIP为如下(a5)或(a6)：(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物BIP为如下(a7)或(a8)：(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物LF为如下(a9)或(a10)：(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物LB为如下(a11)或(a12)：(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。...

【技术特征摘要】
1.引物组合，包括引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB；所述引物F3为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物B3为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物FIP为如下(a5)或(a6)：(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物BIP为如下(a7)或(a8)：(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物LF为如下(a9)或(a10)：(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物LB为如下(a11)或(a12)：(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于：所述引物组合由所述引物F3、所述引物B3、所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物LF和所述引物LB组成。3.权利要求1或2所述引物组合的应用，为(b1)或(b2)：(b1)鉴定弓形虫；(b2)制备用于鉴定弓形虫的试剂盒。4.权利要求1或2所述引物组合的应用，为(b3)或...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶勇，
申请(专利权)人：北京智德医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11