一种利用过表达氮代谢调控蛋白基因的工程菌制备生物絮凝剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用过表达氮代谢调控蛋白基因的工程菌制备生物絮凝剂的方法，本发明专利技术将氮代谢调控蛋白NrgB基因(nrgB)克隆构建重组表达载体，通过电转化的方法将重组质粒导入到地衣芽孢杆菌，构建了工程菌，该工程菌在发酵过程中，絮凝活性提高了98.04％，该工程菌可用于多糖絮凝剂的工业化生产，能够提高絮凝效率并降低成本。

A method for preparation of bioflocculants by engineering bacteria overexpressing genes regulating nitrogen metabolism

【技术实现步骤摘要】
一种利用过表达氮代谢调控蛋白基因的工程菌制备生物絮凝剂的方法
本专利技术属于生物絮凝剂制备
，具体涉及一种利用过表达氮代谢调控蛋白基因的工程菌制备生物絮凝剂的方法。
技术介绍
氮代谢调控蛋白NrgB是PII调节蛋白家族的成员之一(Microbiology，2003，149，3289-3297)，转化NH4+和谷氨酸之间的主要氮代谢通量(MicrobialCellFactories，2017，16(1)：22)，主要起到控制氮代谢流的作用。NrgB是铵盐代谢的正向调控蛋白，最佳氮源谷氨酰胺/谷氨酸不存在时，NrgB感知胞外铵盐的浓度，通过激活谷氨酰胺合成酶(GlnA)调节谷氨酸的合成(Proteomics，2006，6(16)：4565-4585)，将胞内主要氮源由直接利用谷氨酸转向同化吸收铵盐。NrgB在调节氮通量的同时，能够调节絮凝活性物质γ-PGA的合成。谷氨酸是B.1icheniformis属菌株最佳的生长氮源，葡萄糖的存在会抑制NrgB的表达，导致菌体消耗产生的谷氨酸(Proteomics，2007，7(3)：413-423)，而当没有葡萄糖存在时，NrgB表达正常，它是铵盐代谢的正向调控蛋白，可以激活谷氨酰胺合成酶将主要氮源由直接利用谷氨酸转向同化吸收铵盐，最终促进γ-PGA的合成。生物絮凝剂是一种新型絮凝剂，由真菌和细菌等微生物产生，与传统絮凝剂相比，易被生物降解，无毒，无二次污染。组成的絮凝物质主要是多糖，多肽，蛋白质，脂类和核酸(AppliedMicrobiologyandBiotechnology，1998，50(6)：682-691)。其中，多糖和多肽(γ-PGA)是目前研究报告中最常见的两种微生物絮凝物质(CarbohydratePolymers，2011，84(1)：454-458)。γ-PGA作为絮凝活性物质在食品、发酵、水处理、制糖工业和微藻收集等领域具有广阔的应用前景(MolecularMicrobiology，2005，57(3)：717-726；BiotechnologyAdvances，2018，36，1424-1433)。多糖絮凝剂也广泛应用于去除工业废水中的色素、悬浮物和重金属离子(Pb2+，Cd2+，Zn2+)(ColloidsandSurfacesB-Biointerfaces，2005，44(4)：179-186.；BioresourceTechnology，2007，98(2)：361-367.)以及对高岭土溶液(BiotechnologyLetters，1996，18(12)：1459-1464；BioresourceTechnology，2018，255，171-179)和微观小球藻(ScienceofTheTotalEnvironment，2018，634：488-496)的絮凝。然而，低产率，低絮凝活性和高价格等因素限制了生物絮凝剂的规模和产业化，以往，大部分关于生物絮凝剂的报道多指向培养基、生长条件的优化和应用领域(ProcessBiochemistry，2014，49(4：576-582)，关于地衣芽孢杆菌的遗传和代谢途径对絮凝剂合成的调控的报道比较少。对于芽孢杆菌在合成多糖和γ-PGA两种絮凝活性物质的代谢途径的了解不够深入(BiotechnologyAdvances，2018，36，1424-1433)，不利于对该菌的代谢进行调控，因此，通过基因工程改造得到高产优良菌株提高，进一步提高生物絮凝剂活性，同时为絮凝活性物质成分代谢的研究奠定基础，具有重要的经济价值及社会意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用工程菌制备生物絮凝剂的方法。本专利技术的原理如下：本专利技术中的氮代谢调控蛋白NrgB是PII调节蛋白家族的成员之一，转化NH4+和谷氨酸之间的主要氮代谢通量，主要起到控制氮代谢流的作用。NrgB是铵盐代谢的正向调控蛋白，最佳氮源谷氨酰胺/谷氨酸不存在时，NrgB感知胞外铵盐的浓度，通过激活谷氨酰胺合成酶(GlnA)调节谷氨酸的合成，将胞内主要氮源由直接利用谷氨酸转向同化吸收铵盐。NrgB在调节氮通量的同时，能够调节絮凝活性物质γ-PGA的合成。谷氨酸是B.licheniformis属菌株最佳的生长氮源，葡萄糖的存在会抑制NrgB的表达，导致菌体消耗产生的谷氨酸，而当没有葡萄糖存在时，NrgB表达正常，它是铵盐代谢的正向调控蛋白，可以激活谷氨酰胺合成酶将主要氮源由直接利用谷氨酸转向同化吸收铵盐，最终促进γ-PGA的合成。本专利技术的技术方案如下：一种利用过表达氮代谢调控蛋白基因的工程菌制备生物絮凝剂的方法，该工程菌为过表达氮代谢调控蛋白NrgB基因的地衣芽孢杆菌，其中含有负载了如SEQIDNO：01所示的氮代谢调控蛋白NrgB基因的表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL，该地衣芽孢杆菌已于2009年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.2876。在本专利技术的一个优选实施方案中，包括如下步骤：(1)通过如SEQIDNO：02所示的正向引物和如SEQIDNO：03所示的反向引物PCR扩增所述氮代谢调控蛋白NrgB基因，将其插入到表达载体PHY300PLK-PamyL-TtamyL的组成型启动子PamyL下游的多克隆位点，获得PHY300-nrgB过表达质粒；(2)将足够的上述PHY300-nrgB过表达质粒通过电转化导入所述地衣芽孢杆菌中，获得所述工程菌；(3)将上述工程菌的单菌落接种于液体种子培养基中，35-37℃并200rpm的条件下培养12-16h，获得种子培养液；(4)将上述种子培养基以3-5％的体积比接种于发酵培养基中，30-40℃并150-300rpm条件下培养50-60h，获得发酵液；(5)将上述发酵液进行离心，获得上清液；(6)将上述上清液通过乙醇沉淀后，离心获得沉淀；(7)将上述沉淀溶解于超纯水中，进行真空冷冻干燥，即得所述生物絮凝剂。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述种子培养基由以下配比的原料组成，单位为g/L：葡萄糖7-12，酵母膏0.3-0.6，尿素0.3-0.6，KH2PO40.1-0.3，K2HPO40.1-0.3，NaCl0.1-0.3，MgSO4·7H2O0.2-0.5，蒸馏水，pH7.2-8.0。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述发酵培养基由以下配比原料组成，单位为g/L：葡萄糖13-16，酵母膏0.5-1，尿素1-3，KH2PO44-6，K2HPO41-3，NaCl1-3，MgSO4·7H2O0.01-0.1，蒸馏水，pH7.2-8.0。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤(6)中，乙醇沉淀具体为：在所述上清液中加入3-5倍体积的无水乙醇，于3-5℃静置10-13h。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤(6)中，离心的速度为5000-7000rpm，离心的时间为12-16min，离心的温度为3-5℃。本专利技术的有益效果是：本专利技术将氮代谢调控蛋白NrgB基因(nrgB)克隆构建重组表达载体，通过电转化的方法将重组质粒导入到地衣芽孢杆菌，构建了工程菌，该工程菌在发酵过程中，絮凝活性提高了98.04％，该工程菌可用于多糖絮凝剂的工本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用过表达氮代谢调控蛋白基因的工程菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于：该工程菌为过表达氮代谢调控蛋白NrgB基因的地衣芽孢杆菌，其中含有负载了如SEQ ID NO：01所示的氮代谢调控蛋白NrgB基因的表达载体PHY300PLK‑PamyL‑TTamyL，该地衣芽孢杆菌已于2009年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2876。

【技术特征摘要】
1.一种利用过表达氮代谢调控蛋白基因的工程菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于：该工程菌为过表达氮代谢调控蛋白NrgB基因的地衣芽孢杆菌，其中含有负载了如SEQIDNO：01所示的氮代谢调控蛋白NrgB基因的表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL，该地衣芽孢杆菌已于2009年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.2876。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)通过如SEQIDNO：02所示的正向引物和如SEQIDNO：03所示的反向引物PCR扩增所述氮代谢调控蛋白NrgB基因，将其插入到表达载体PHY300PLK-PamyL-TtamyL的组成型启动子PamyL下游的多克隆位点，获得PHY300-nrgB过表达质粒；(2)将足够的上述PHY300-nrgB过表达质粒通过电转化导入所述地衣芽孢杆菌中，获得所述工程菌；(3)将上述工程菌的单菌落接种于液体种子培养基中，35-37℃并200rpm的条件下培养12-16h，获得种子培养液；(4)将上述种子培养基以3-5％的体积比接种于发酵培养基中，30-40℃并150-300rpm条...

【专利技术属性】
技术研发人员：何宁，王玲伟，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35