用于扩增夜蛾科昆虫HSC70 CDS区的引物及其扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种用于扩增夜蛾科昆虫HSC70 CDS区的引物，包括：正向引物F：5’‑GTCAACGACTGAGATAGTT‑3；反向引物R：5’‑GTACTGTAGTTGAATACTGC‑3。本发明专利技术寻找、设计了一对引物，可直接扩增夜蛾科昆虫HSC70的全长编码区，大大降低了HSC70扩增的成本，同时为深入研究夜蛾科昆虫HSC70的功能奠定基础。

Primers for amplifying HSC70 CDS region of Noctuidae insects and their amplification methods

【技术实现步骤摘要】
用于扩增夜蛾科昆虫HSC70CDS区的引物及其扩增方法
本专利技术涉及生物领域，具体涉及一种用于扩增夜蛾科昆虫HSC70CDS区的引物及其扩增方法。
技术介绍
热激蛋白（Heatshockproteins，HSPs）又称热休克蛋白，是生物体受多种胁迫因子刺激后新合成的一类高度保守的蛋白质，广泛存在于真核和原核生物中。HSPs是一个蛋白质超家族，依据分子量大小和序列同源性可分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和sHSPs。在众多的HSPs中HSP70家族保守性最高，是目前为止研究最多最深入的热休克蛋白家族成员之一。编码HSP70蛋白的基因一般分为2类，第一类为诱导型HSP70，参与两种伴侣功能，该基因在受到胁迫时可以迅速上调，当胁迫消失的时候便回归至正常的表达水平，一般认为其与细胞应激保护相关；第二类为高度保守的组成型HSC70(HeatShockCognate70，HSC70)，该基因在正常情况下编码组成型蛋白，在环境胁迫下可被诱导表达成诱导型HSP70。两种蛋白在基因结构上最主要的区别是组成型表达的HSC70含有内含子，而诱导型表达的HSP70不含有内含子。HSC70的功能主要是参与新生肽链的折叠、组装与蛋白前体转运，清除受损蛋白和永久变性蛋白，使变性蛋白恢复正常构象，对细胞起修复和保护作用，从而有效提高机体的耐热性和抗应激能力。目前，基因全长序列的获得主要依赖于RACE法，虽然该方法已经十分成熟，但存在以下几个缺点：一是逆转录合成5’和3’所需的RNA质量要求较高；二是RACE试剂盒比较昂贵；三是虽然RACE技术已相当成熟，但对一些表达丰度较低的基因难以获得全长，特别是5’端序列。HSC70作为分子伴侣，在调控昆虫的生长发育和抗逆性等方面发挥重要作用，因而被认为是害虫防治的一个分子靶标。夜蛾科昆虫是鳞翅目中一个重要类群，其中多数物种是农业上的重要害虫。利用现代分子生物学技术（如RNAi和转基因技术）来沉默HSC70的表达成为控制这些害虫的全新途径，而获得HSC70基因的全长序列是研究其功能的前提和关键。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术通过比对常见夜蛾科昆虫HSC70基因的全长序列，寻找、设计了一对引物，可直接扩增夜蛾科昆虫HSC70的全长编码区，大大降低了HSC70扩增的成本，同时为深入研究夜蛾科昆虫HSC70的功能奠定基础。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：用于扩增夜蛾科昆虫HSC70CDS区的引物，包括：正向引物F：5’-GTCAACGACTGAGATAGTT-3；反向引物R：5’-GTACTGTAGTTGAATACTGC-3。本专利技术还提供了一种利用上述的引物扩增夜蛾科昆虫HSC70CDS区的方法，包括如下步骤：S1、cDNA的合成采用FastQuantRTKit进行，以1μg的总RNA为模板，体积为20μL，具体方法如下：S11、按照5×gDNABuffer2μL、TotalRNA1μL、RNase-FreeddH2O7μL的配方配制基因组DNA去除体系混合液，混匀并短暂离心，并置于42℃下孵育3min，然后置于冰上；S12、按照10×FastRTBuffer2μL、RTEnzymeMix1μL、FQ-RTPrimerMix2μL、RNase-FreeddH2O5μL的配方配制反转录体系配制混合液；S13、将反转录反应中的混合液加入步骤S11所得的反应液中，充分混匀，在42℃孵育15min，95℃孵育3min，反应结束后将得到的cDNA存于-20℃下备用；S2、HSC70的PCR扩增以反转录的cDNA为模板，采用LATaq酶进行RT-PCR扩增，反应体系为25μL，包括模板1μL、2.5mmol/L的dNTPs2μL、10×ExTaqBuffer2.5μL、10mmol/L的上游引物1μL、10mmol/L的下游引物1μL、LATaq酶0.25μL，ddH2O17.25μL；PCR产物采用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳；对扩增成功的HSC70目标条带采用E.Z.N.AGelExtractionKit进行回收纯化，并采用PGM-Simple-TFast试剂盒进行HSC70克隆，挑取阳性克隆。进一步地，所述步骤S2中采用TouchdownPCR进行扩增，PCR参数如下：94℃3min，94℃30s，64-44℃30s(每个循环降1℃），72℃1min，共19个循环；之后94℃30s，44℃30s，72℃2min，共25个循环；最后在72℃下延伸10min。本专利技术具有以下有益效果：寻找、设计了一对引物，可直接扩增夜蛾科昆虫HSC70的全长编码区，大大降低了HSC70扩增的成本，同时为深入研究夜蛾科昆虫HSC70的功能奠定基础。附图说明图1为鳞翅目夜蛾科的热休克蛋白70（HSC70）基因的（A）5’端和（B）3’UTR区的对比图；图中：符号：“-”表示比对的间隙，“*”表示比对中的保守为点。下划线表示通用引物的位置。MsHSC70:东方黏虫HSC70;XCHSC70:八字地老虎HSC70;HzHSC70:美洲棉铃虫HSC70;AiHSC70:小地老虎HSC70;SiHSC70:大螟HSC70;MbHSC70:甘蓝夜蛾HSC70;SlHSC70:斜纹夜蛾HSC70;HaHSC70:棉铃虫HSC70。图2为5种昆虫HSC70的扩增结果；注：M：DNAmarker，1：东方黏虫，2：大螟，3：斜纹夜蛾，4：劳氏黏虫，5：甜菜夜蛾。图3为5种夜蛾科昆虫HSC70氨基酸序列的对比图；注：HSC70家族的三个保守特征和一个结合位点，一个非细胞器结构域以及保守EEVD四肽序列以红框显示；MlHSC70:劳氏黏虫HSC70；SxHSC70:甜菜夜蛾HSC70；SiHSC70:大螟HSC70；MsHSC70:东方黏虫HSC70；SlHSC70:斜纹夜蛾HSC70。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。实施例仪器与试剂以下实施例中所使用的试剂包括总RNA提取试剂盒（北京天根生化有限公司），逆转录试剂盒（北京天根生化有限公司）、PGM-Simple-TFast克隆试剂盒（北京天根生化有限公司）、LAtaq酶（Takra）和胶回收试剂盒（OMEGA公司）等。所使用的仪器包括PCR仪（Bio-RAD），高速冷冻离心机(Thermal公司)，紫外分光光度计(Thermal公司)，超低温冰箱(Thermal公司)、凝胶成像系统（北京六一生物科技有限公司）等。引物设计从GenBank中下载夜蛾科昆虫HSC70序列用于引物设计，物种名称和对应的GenBank号如下：东方黏虫（MH042023）、斜纹夜蛾（HM046611）、棉铃虫(FJ432703)、美洲棉铃虫（GQ389712）、八字地老虎（KC844151）、甘蓝夜蛾（AB251896）、小地老虎（JF809817）和大螟（KJ639908）。使用Clustalw对序列进行比对，设计引物。RNA提取与逆转录按照TRNzol-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于扩增夜蛾科昆虫HSC70 CDS区的引物，其特征在于：包括：正向引物F：5’‑GTCAACGACTGAGATAGTT‑3；反向引物R：5’‑GTACTGTAGTTGAATACTGC‑3。

【技术特征摘要】
1.用于扩增夜蛾科昆虫HSC70CDS区的引物，其特征在于：包括：正向引物F：5’-GTCAACGACTGAGATAGTT-3；反向引物R：5’-GTACTGTAGTTGAATACTGC-3。2.一种利用权利要求1所述的引物扩增夜蛾科昆虫HSC70CDS区的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、cDNA的合成采用FastQuantRTKit进行，以1μg的总RNA为模板，体积为20μL，具体方法如下：S11、按照5×gDNABuffer2μL、TotalRNA1μL、RNase-FreeddH2O7μL的配方配制基因组DNA去除体系混合液，混匀并短暂离心，并置于42℃下孵育3min，然后置于冰上；S12、按照10×FastRTBuffer2μL、RTEnzymeMix1μL、FQ-RTPrimerMix2μL、RNase-FreeddH2O5μL的配方配制反转录体系配制混合液；S13、将反转录反应中的混合液加入步骤S11所得的反应液中，充分混匀，在42℃孵育15min，95℃孵育3...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鸿波，戴长庚，胡阳，
申请(专利权)人：贵州省植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：贵州,52