一种SERS基底的制备及其在癌症检测方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种SERS基底的制备及其在癌症检测方面的应用，属于纳米材料领域。本发明专利技术公开的SERS基底为镀80nm Au的TiO2反蛋白石，TiO2反蛋白石的孔径为290nm。SERS基底中TiO2反蛋白石孔径和待检测物外泌体直径(90nm左右)匹配，能够使外泌体与SERS基底充分接触，另一方面孔径为290nm的TiO2反蛋白石在633nm激光激发下在检测分析物时能够产生慢光效应，进而能更好的得到外泌体本身的SERS信号。利用本发明专利技术能够快速分析血浆中提取得到的外泌体蛋白的磷酸化程度进而诊断癌症，其用时短、灵敏度高，本发明专利技术为非侵入性体外癌症快速诊断提供一种新的思路。

Preparation of a SERS Base and Its Application in Cancer Detection

【技术实现步骤摘要】
一种SERS基底的制备及其在癌症检测方面的应用
本专利技术属于纳米材料领域，具体涉及一种SERS基底的制备及其在分析血浆中外泌体蛋白磷酸化程度进而诊断癌症方面的应用。
技术介绍
外泌体是源于内吞作用的小脂双层膜包裹的纳米囊泡(直径30-120nm)。所有细胞都能分泌外泌体因而其广泛存在于唾液、尿液、牛奶和血液等生物体液中。越来越多的证据表明，外泌体在肿瘤生物学和转移中起着重要作用并携带有亲代细胞的许多特征，如蛋白质、DNA和RNA分子，因此其作为细胞信使成为了一种癌症和疾病的潜在生物标志物。目前，癌症的主要诊断方法是侵入性活检。而外泌体的深入研究表明其作为癌症标志物可以在癌症诊断中作为一种非侵入性手段实现体外癌症检测。另外蛋白质发生磷酸化是重要的翻译后修饰，它与信号传导、细胞周期、生长发育以及癌症机理等诸多生物学问题有密切关系，以往研究表明通过生物质谱分析发现乳腺癌病人血浆中的外泌体蛋白磷酸化程度远远高于正常人，因此研究蛋白质磷酸化对阐明蛋白质功能具有重要意义。两者结合后目前外泌体磷酸化蛋白已经被视为癌症标志物的主要体现形式。表面增强拉曼散射(SurfaceEnhancedRamanScattering，SERS)作为一种物理光谱学手段，其主要原理是利用贵金属(Au、Ag、Cu等)基底与激发激光之间的等离激元共振将基底表面附近的分子拉曼散射光谱显著放大，进而得到分子内部结构信息，具有极高的灵敏性。目前利用SERS方法解决生物学问题是一大热点，其主要原因是传统医学检测手段存在耗时长、效率低的弊端，而SERS光谱采集则往往只需要极短的时间(10分钟内)且灵敏度极高(增强因子可达1013)。目前将SERS技术应用于病理学诊断的主流方法都是先将SERS基底与生物分子结合，然后通过拉曼探针分子的信号变化间接性的分析所要研究的生物标志物(如RNA、DNA、蛋白质、多肽等等)，往往很难得到生物标志物的本质信息。因此寻找一种能直接高效检测生物标志物本质信息并达到病理学诊断目的的SERS方法是迫待解决的一个问题。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术所需要解决的技术问题是提供一种SERS基底的制备及其在癌症检测方面的应用，本专利技术所提供的SERS基底可用于分析外泌体蛋白磷酸化程度进行有效诊断癌症并有望用于癌症预检测。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种SERS基底，为镀80nmAu的TiO2反蛋白石，TiO2反蛋白石的孔径为290nm。SERS基底中TiO2反蛋白石孔径和外泌体直径(90nm左右)匹配，能够使外泌体与SERS基底充分接触，另一方面孔径为290nm的TiO2反蛋白石在633nm激光激发下在检测分析物时能够产生慢光效应，进而能更好的得到外泌体本身的SERS信号。所述SERS基底的制备方法包括如下步骤：(1)利用旋涂法将直径为400nm的聚苯乙烯微球悬浮液旋涂于二氧化硅片衬底上，干燥后得到多层密排聚苯乙烯微球阵列作为掩膜板；其中干燥温度优选为30～45℃。(2)通过浸涂法在多层密排聚苯乙烯微球阵列的微球间隙处加入TiO2前驱液，再利用空气退火的方法将微球去掉，由于退火过程中TiO2骨架会缩小最终可得到孔径为290nm的TiO2反蛋白石。(3)为进一步优化基底的SERS性能，再利用热蒸镀在290nmTiO2反蛋白石表面蒸镀80nm厚的Au，得到SERS基底80nm@290nmTiO2反蛋白石。优选的，步骤(1)中利用旋涂法制备多层密排聚苯乙烯微球阵列的转速为350～500r/min，时间为30～60s。优选的，步骤(2)中空气退火的方法为用退火炉在空气氛围下450～550℃退火2～3h，升温速率为1～3℃/min。优选的，步骤(2)为：将多层密排聚苯乙烯微球阵列浸泡在TiO2前驱液中30～60min后利用旋涂去掉表面多余溶液，旋涂转速为800～1000r/min，时间为30～60s；再用退火炉在空气氛围下450～550℃退火2～3h，升温速率为1～3℃/min。所述SERS基底能够用于分析从血浆中提取得外泌体的蛋白磷酸化程度，进行诊断癌症。将所述SERS基底用于分析外泌体蛋白磷酸化程度的方法包括如下步骤：将从正常人、前列腺增生病人、前列腺癌病人血浆中提取得到的外泌体溶液滴在所述SERS基底表面，干燥后用633nm激光激发得到外泌体的SERS光谱，由于SERS增强以及SERS基底本身的慢光效应可以得到良好的外泌体的本质SERS光谱，通过比较SERS光谱中1087cm-1(对应磷酸根的振动键)处的拉曼峰强来确定不同外泌体的蛋白磷酸化程度，进而达到诊断癌症的目的。所述SERS基底能够用于制备分析血浆中提取得到的外泌体蛋白磷酸化程度或诊断癌症的检测系统。利用所述SERS基底制备的检测系统可以用于体外分析正常人、前列腺增生病人、前列腺癌病人血浆中提取得到的外泌体整体的蛋白磷酸化程度检测进而达到非侵入性体外检测癌症的目的。一种分析外泌体蛋白磷酸化程度或诊断癌症的检测系统，主要包含所述SERS基底，还包含正常人外泌体对照、前列腺增生病人外泌体对照、前列腺癌病人外泌体对照。本专利技术利用SERS技术分析外泌体蛋白的磷酸化进而诊断癌症，相对于常规分析外泌体蛋白磷酸化程度的医学手段而言(如生物质谱)，用时短、灵敏度高，为体外癌症快速诊断提供一种新的思路。本专利技术具有如下优点和有益效果：(1)SERS基底的孔径(290nm)与外泌体直径(90nm)匹配良好；(2)SERS基底中TiO2反蛋白石的孔径(290nm)与激发激光的波长(633nm)匹配良好，可以恰好产生慢光效应，增强待检测物SERS信号；(3)得到外泌体本质信息光谱；(4)快速有效的非侵入性诊断癌症并有望用于癌症预检测附图说明图1是实施例1分别热蒸镀0/20/40/60/80/100nm的TiO2反蛋白石SERS基底的SEM图。图2是实施例1分别热蒸镀0/20/40/60/80/100nm的TiO2反蛋白石SERS基底检测10-5mol/L的亚甲蓝溶液的SERS图谱。图3是外泌体掉入80nmAu@290nmTiO2反蛋白石SERS基底上的SEM图，虚线圈内代表外泌体的位置。图4是实施例1正常人、前列腺增生病人外泌体对应的SERS图谱，插图为对应的1087cm-1处的拉曼峰强。图5是实施例2正常人、前列腺癌病人外泌体对应的SERS图谱，插图为对应的1087cm-1处的拉曼峰强。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1(1)SERS基底的制备1)利用旋涂法将50μL量分数为5％的直径为400nm的聚苯乙烯微球悬浮液旋涂于1cm×1cm大小二氧化硅片衬底上(衬底提前用乙醇、丙酮、去离子水依次清洗10min后备用)，35℃燥后得到多层密排聚苯乙烯微球阵列作为掩膜板。其中，旋涂法的具体条件为：转速为450r/min，时间为30s。2)将多层密排聚苯乙烯微球阵列浸入TiO2前驱液(钛酸四丁酯:盐酸:去离子水＝1:10:10，体积比，所用化学溶液均为分析纯)中浸泡30min取出，再次利用旋涂法除去表面多余的前驱液，转速为1000r/min，时间为30s；然后通过空气退火的方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种SERS基底，其特征在于：所述SERS基底为镀80nm Au的TiO2反蛋白石，TiO2反蛋白石的孔径为290nm。

【技术特征摘要】
1.一种SERS基底，其特征在于：所述SERS基底为镀80nmAu的TiO2反蛋白石，TiO2反蛋白石的孔径为290nm。2.权利要求1所述的SERS基底的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)利用旋涂法将直径为400nm的聚苯乙烯微球悬浮液旋涂于二氧化硅片衬底上，干燥后得到多层密排聚苯乙烯微球阵列作为掩膜板；(2)通过浸涂法在多层密排聚苯乙烯微球阵列的微球间隙处加入TiO2前驱液，再利用空气退火的方法将微球去掉，得到孔径为290nm的TiO2反蛋白石；(3)利用热蒸镀在290nmTiO2反蛋白石表面蒸镀80nm厚的Au，得到SERS基底80nm@290nmTiO2反蛋白石。3.根据权利要求2所述的SERS基底的制备方法，其特征在于：步骤(1)中利用旋涂法制备多层密排聚苯乙烯微球阵列的转速为350～500r/min，时间为30～60s。4.根据权利要求2所述的SERS基底的制备方法，其特征在于：步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖湘衡，董仕练，蒋昌忠，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42