一种利用miR-203/SNAI2轴调节前列腺癌细胞在体外迁移的方法技术

本发明专利技术涉及分子检测技术领域，尤其涉及microRNA检测和治疗前列腺癌(PCa)的方法。本发明专利技术提供了miR‑203/SNAI2轴对前列腺癌的体外生物学特性的影响。具体的，在DU145和PC3细胞中表达miR‑203抑制SNAI2表达。miR‑203抑制了前列腺癌细胞的增殖、迁移、内皮细胞形成和肿瘤干细胞的形成。

A method of regulating the migration of prostate cancer cells in vitro by using the microRNA-203/SNAI2 axis

【技术实现步骤摘要】
一种利用miR-203/SNAI2轴调节前列腺癌细胞在体外迁移的方法
本专利技术涉及分子检测
，尤其涉及microRNA检测和治疗前列腺癌(PCa)的方法。本专利技术提供了miR-203/SNAI2轴可作为PCa的诊断和治疗靶点。
技术介绍
前列腺癌(PCa)是如今全球第二常见男性癌症死亡的主要原因之一。PCa的形成和发展是多步骤的过程，包括正常前列腺上皮癌变前的病变转变，高档前列腺上皮内瘤(PIN)，局部侵袭性前列腺癌和远距离转移。广泛的研究表明，对特定基因包括微小RNAs(miRNAs)和长非编码RNA(lncRNAs)的解除管制，是PCa的发病机制和进展的主要原因。尽管如此，与其他癌症相比，PCa中miRNA的表达模式和功能仍未被完全阐明，尽管有证据表明，在PCa的肿瘤发生和化疗抵抗中，miRNA表达的全球解除管制。确定miRNAs在前列腺肿瘤形成和进展中的作用机制，对我们更好地了解前列腺癌的性质有重要作用，并且有助于确定治疗干预的潜在靶点。MicroRNA是一类长度约20-24个核苷酸序列的短小非编码mRNAs，通过转录绑定3’-未翻译区(3’-UTRs)抑制目标基因的表达。MiRNAs参与调控包括致癌在内的多种生理和病理过程。对miRNAs的解除管制有助于多种癌症的发展，包括PCa。例如，下调PCa中的肿瘤抑制物，包括miR-101、miR-126*、miR-145、miR-146a、miR-224、miR-330、miR-34a、miR-200家族，发现与先进的临床分期、肿瘤转移和异位表达相关的致癌miRNAs包括miR-221/222、miR-21、miR-141、miR-18a和miR-125b，这表明PCa进展有更高的风险。SNAI2编码了Snail家族C2H2锌指转录因子，并参与了不同癌症的发展。SNAI2作为一种转录抑制因子，通过与E-box的结合来调节与DNA的序列特异性的相互作用。该蛋白参与上皮间充质转移并控制干细胞，这揭示了这一转录因子在肿瘤转移中具有重要意义。SNAI2在包括前列腺在内的人体组织中广泛表达。在体内异种移植实验表明，SNAI2促进前列腺癌细胞的迁移和侵袭，并介导了细胞周期蛋白D1诱导的肿瘤发生。PCa中SNAI2的沉默抑制了多能性基因的表达，激活了特异性的转移抑制因子。在选择的PCa细胞中，SNAI2的异位表达促进了它们的自我更新，并增加了转移潜能，使其具有高度恶性的特性。SNAI2可能是防止PCa进展的分子方法的关键目标。然而，在前列腺癌的形成和发展过程中，miRNAs与SNAI2之间的相互作用并没有得到很好的阐明。越来越多的证据表明，miR-203参与多种生理和病理过程，包括上皮分化、癌细胞增殖、转化和凋亡。有趣的是，不同的文献表明，miR-203参与GSK-3β/β-CATENINN通路。例如，AnnieZhang等人报道，miR-203抑制了与PIK3CA、p38MAPK、c-Jun和GSK-3信号信号相关的肝癌的增殖。在黑素瘤细胞，β-catenin压制转录miR-203。在本研究中，我们旨在系统地阐明miR-203/SNAI2在前列腺癌中的确切作用。我们表明，miR-20/SNAI2轴调控肿瘤发生，血管生成，具备干细胞能力，在前列腺癌转移可能通过调节GSK-3β/β-CATENIN信号通路。这些发现为miR-203和SNAI2在恶性细胞中的作用提供了新的见解。
技术实现思路
本专利技术确定了miR-203/SNAI2轴在体外调节前列腺细胞的迁移。为了描述miR-203/SNAI2轴在前列腺癌进展过程中的作用，我们用pSIN-miR-203转染入DU145和PC3细胞。Transwell试验的目的是探讨miR-203对前列腺癌细胞迁移的影响。如图1A-C所示，miR-203减少了DU145和PC3细胞的迁移(p<0.05)。与只转染pSIN-miR-203(p<0.05)相比，pSIN-miR-203和pSIN-SNAI2共同转染后细胞迁移能力增加。伤口愈合试验也显示相似的结果(图1D-G)。附图说明图1MiR-203/SNAI2轴调节前列腺癌细胞在体外的迁移。A、B和C。由Boyden小室检测法在转染了pSIN-miR-203或共转染了miR-203和SNAI2的的情况下，分别测定DU145和PC3细胞迁移潜力的表达(A)和定量(B和C)。测量尺为：100μm。D、E、F和G。在感染上的pSIN-miR-203或pSIN-miR-203和pSIN-miR-203的感染，在48h后，用创面愈合试验(D和E)和定量的伤口面积(F和G)的百分率来描述。测量尺为：250μm。所有数据均通过t检验进行统计分析。不同的字母表示差异具有统计学意义p<0.05。具体实施方式1.细胞培养5个前列腺癌细胞株(DU145、PC3、22Rv1、LNCaP和C4-2)和2个永生化和未转化的前列腺上皮细胞系(PZ-HPV-7和RWPE1)从美国ATCC获得。细胞按照ATCC的标准手册进行培养。人类脐静脉内皮细胞（HuVECs）购买于LifeTechnologies(Carlsbad，California，USA)，根据说明书进行培养。2.半定量RT-PCR和qRT-PCR半定量RT-PCR和qRT-PCR均按之前描述进行。引物序列如下：5´-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTAGTG-3´(specificRTprimerformiR-203)，5´-GTGCAGGGTCCGAGGT-3´(realtimePCR，miR-203，forward)，5´-GCCGCGTGAAATGTTTAGG-3´(realtimePCR，miR-203，reverse)；5´-CTCGCTTCGGCAGCACA-3´(realtimePCR，U6，forward)，5´-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3´(realtimePCR，U6，reverse)。3.Transwell侵染检测细胞(5×104)悬浮于200μ1含1%FBS的基本培养基中并接种于transwell上室中。下室为500μl含10%FBS的培养基。孵化24h后，迁移的细胞用4%多聚甲醛固定(Beyotime)15min，用0.1%结晶紫染色15min，用显微镜(Olympus)拍照。然后用200μ1的醋酸(33%，v/v)消除染色的结晶紫，并用ELISAreader(MoecularDevices，SunnyvaleCA，USA)在OD570测量吸光值。4.伤口愈合实验处理的细胞(1×106)在6孔板中培养过夜。覆盖率达到到达90%时使用200μl枪头刮动细胞层，然后立即用含1%胎牛血清的生长培养基洗两次。在0、12、24和48h用显微镜捕捉这些板块的照片。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用miR‑203/SNAI2轴调节前列腺癌细胞在体外迁移的方法。

【技术特征摘要】
1.一种利用miR-203/SNAI2轴调节前列腺癌细胞在体外迁移的方法。2.根据权利要求1所述，其特征在于，miR-203减少了DU145和PC3细胞的迁移。3.根据权利要求2所述，其特征在于，与只转染pSIN-miR-203(p<0.05)相比，pSIN-miR-203和pSIN-SNAI2共同转...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志潜，
申请(专利权)人：天津科美生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12