一种利用三种糖基转移酶制备Globotriose-连接的活性糖肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose‑连接活性糖肽的方法，首先是利用N‑糖基转移酶ApNGT将UDP‑Glc转移至含有N‑X(X≠P)‑T/S糖基化位点的多肽上的Asn氨基酸残基上，随后在β‑1,4‑半乳糖基转移酶LgtB的作用下合成Peptide‑Lactose，然后在α‑1,4‑半乳糖基转移酶LgtC的作用下合成产物，再使用高压液相色谱进行纯化，洗脱样品浓缩，产物冷冻干燥后即获得具有生物活性的Peptide‑globotriose活性糖肽。本发明专利技术方法为大量快速的生产多种基于Globotriose的寡糖肽提供了可能，具有广阔的应用前景。

A Method for Preparing Globotriose-linked Active Glycopeptides Using Three Glycosyltransferases

【技术实现步骤摘要】
一种利用三种糖基转移酶制备Globotriose-连接的活性糖肽的方法
本专利技术涉及一种活性糖肽的制备方法，尤其涉及一种利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose-连接活性糖肽的方法，属于生物

技术介绍
Globotriose(α-Gal(1→4)β-Gal(1→4)β-Glc，Gb3)是中性糖鞘脂globotrio-神经酰胺(globotriaosylceramide，Gb3-cer)的碳水化合物部分，参与许多重要的生理学过程。Gb3位于细胞膜上，在细胞的生长、分化以及癌症转移等方面有着重要的作用。有研究表明Gb3在乳腺癌和淋巴瘤等中过量表达，可以作为一种有效分子标记应用于肿瘤发展过程中。另外，globotriose还是一些肿瘤相关糖抗原如GloboH和SSEA4糖链的核心结构，而这些糖抗原与人类的肺癌、脑癌的产生与发展存在着千丝万缕的联系，因此globotriose可在癌症疫苗的开发研究过程中扮演相关肿瘤糖抗原的合成前体进行应用。同时病原菌O157:H7的志贺氏毒素(Stx)也是通过与肠道细胞表面的Globotriose结合引起痢疾甚至致命性综合尿毒症本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose‑连接活性糖肽的方法，步骤是：(1)以含有N‑X(X≠P)‑T/S的N‑糖基化位点的多肽为起始底物，利用N‑糖基转移酶ApNGT合成Peptide‑Glc活性糖肽；(2)以获得的Peptide‑Glc活性糖肽，利用β‑1,4‑半乳糖基转移酶LgtB合成Peptide‑Glc‑Gal活性糖肽；(3)以获得的Peptide‑Glc‑Gal活性糖肽，利用α‑1,4‑半乳糖基转移酶LgtC合成制得Peptide‑globotriose活性糖肽。

【技术特征摘要】
1.一种利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose-连接活性糖肽的方法，步骤是：(1)以含有N-X(X≠P)-T/S的N-糖基化位点的多肽为起始底物，利用N-糖基转移酶ApNGT合成Peptide-Glc活性糖肽；(2)以获得的Peptide-Glc活性糖肽，利用β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB合成Peptide-Glc-Gal活性糖肽；(3)以获得的Peptide-Glc-Gal活性糖肽，利用α-1,4-半乳糖基转移酶LgtC合成制得Peptide-globotriose活性糖肽。2.根据权利要求1所述利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose-连接活性糖肽的方法，其特征在于：所述含有N-X(X≠P)-T/S的N-糖基化位点的多肽选多肽DANYTK、多肽WPAVGNCSSALRW、多肽KYPALNVTMPN或多肽VLRVANITRLQ。3.根据权利要求1所述利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose-连接活性糖肽的方法，其特征在于：所述的N-糖基转移酶ApNGT来自Actinobacilluspleuropneumoniae；所述的β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB来自NeisseriameningitidesMC58；所述的α-1,4-半乳糖基转移酶LgtC来自NeisseriameningitidesMC58。4.根据权利要求1所述利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose-连接活性糖肽的方法，其特征在于：步骤(1)所述利用N-糖基转移酶ApNGT合成Peptide-Glc活性糖肽的步骤是：1)按照终浓度计，以含有N-X(X≠P)-T/S的N-糖基化位点的多肽0.8～1.0mM，UDP-Glc8～10mM，pH7.0～8.0的10～300mMHEPES缓冲液为反应体系，加入2～5mg/mL的N-糖基转移酶ApNGT；2)置30-37℃水浴条件下，反应时间5～50h；3)将反应后的混合液100℃处理5～8min终止反应，然后以12000r/min离心5～15min取反应上清液使用高效液相色谱(HPLC)按常规方式进行分析和纯化，洗脱样品使用旋转蒸发仪进行浓缩，产物冷冻干燥后即得Peptide-Glc活性糖肽。5.根据权利要求4所述利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose-连接活性糖肽的方法，其特征在于：步骤1)中，按照终浓度计，含有N-X(X≠P)-T/S的N-糖基化位点的多肽1.0mM，UDP-Glc10mM，pH8.0的10mMHEPES缓冲液为反应体系，加入4mg/mL的N-糖基转移酶ApNGT；步骤2)中，所述水浴选30℃，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈敏，孔蕴，刘芳，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37