一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法技术

本发明专利技术提供一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法，通过上调Bmp8a蛋白的表达量来增强鱼类的抗病毒免疫力。本发明专利技术首先提供Bmp8a蛋白的一种用途，是在制备提高鱼类抗病毒免疫力的制品中的应用。本发明专利技术证明bmp8a基因敲除后的斑马鱼的抗病毒能力显著下降，而过表达Bmp8a可显著上调干扰素等抗病毒相关基因的表达，显示Bmp8a在抗病毒免疫中具有重要作用。通过在鱼类中注射Bmp8a成熟肽，增强鱼类的抗病毒免疫力，从而达到防治鱼类病毒性疾病的目的。

A Method for Improving the Antiviral Immunity of Fish

【技术实现步骤摘要】
一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法
本专利技术属于鱼类免疫
，具体涉及一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法。
技术介绍
鱼类病毒性疾病传染性强、传播速度快、死亡率高，严重危害水产养殖业，能够造成重大经济损失。国内外已经研发和生产了少数鱼类病毒性疾病的疫苗，但仍存在免疫效果差、血清型差异等问题，难以在生产实践中应用。因此，目前鱼类病毒性疾病的治疗还存在相当大难度，主要以预防为主。骨形态发生蛋白(BoneMorphogeneticProtein，BMP)家族是一类疏水性糖蛋白家族，属于TransformingGrowthFactorBeta(TGF-β)超家族。BMP8是BMP家族的众多成员之一，在斑马鱼中，Bmp8只有Bmp8a一种形式。斑马鱼Bmp8a首先形成一个含有433个氨基酸的前肽，活性的Bmp8a成熟肽由羧基端的137个氨基酸组成。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法，通过上调Bmp8a蛋白的表达量来增强鱼类的抗病毒免疫力，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供Bmp8a蛋白的一种用途，是在制备提高鱼类抗病毒免疫力的制品中的应用；所述的制品，为注射用液体蛋白制剂；本专利技术还提供Bmp8a蛋白的另一种用途，是通过检测Bmp8a蛋白的表达量来筛选抗病毒能力强的亲鱼；所述的Bmp8a蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO:1；其成熟肽的氨基酸序列为SEQIDNO:2；编码上述的Bmp8a蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:3。本专利技术另一个方面还提供一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法，通过上调bmp8a蛋白的表达量来增强鱼类的抗病毒免疫力。本专利技术将bmp8a基因敲除后的斑马鱼抗病毒能力显著下降，显示Bmp8a在抗病毒免疫中具有重要作用。通过在饲料中添加Bmp8a成熟肽或在鱼类中注射Bmp8a成熟肽，增强鱼类的抗病毒免疫力，从而达到防治鱼类病毒性疾病的目的。附图说明图1：斑马鱼bmp8a基因的组织表达图；图2：斑马鱼bmp8a基因TALEN靶位点设计图；图3：斑马鱼bmp8a基因TALEN靶位点上下游嵌套PCR电泳图。M：DL2000Maker；1：外侧PCR产物；2：内侧PCR产物。图4：斑马鱼bmp8a基因TALEN靶位点突变检测结果。(A)：HphⅠ酶切PCR产物电泳图。M：DL2000Maker；1-9：注射TALENmRNA胚胎；WT：未注射TALENmRNA的野生型胚胎。(B)：图(A)中1、2、8号胚胎bmp8a基因突变测序结果。图5：利用TALEN技术对斑马鱼bmp8a基因进行敲除示意图。图6：斑马鱼bmp8a基因敲除后，MHC1基因表达显著下降图。图7：GCRV病毒刺激可显著上调斑马鱼组织中bmp8a基因表达图。图8：GCRV病毒刺激可显著上调斑马鱼ZFL细胞中bmp8a基因的表达图。图9：过表达斑马鱼Bmp8a可显著上调抗病毒相关基因的表达图。图10：过表达斑马鱼Bmp8a可显著抑制病毒基因VP5的表达图。图11：bmp8a突变体斑马鱼更易受到病毒感染图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术进行详细的描述。实施例1：bmp8a基因敲除实验斑马鱼Bmp8a蛋白DE氨基酸序列为SEQIDNO:1,其对应的成熟肽的氨基酸序列为SEQIDNO:2，编码上述Bmp8a蛋白的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3。斑马鱼bmp8a基因主要表达在斑马鱼的精巢、肠和皮肤组织中，脑组织中表达次之，心脏、肌肉组织中表达量相对较低(图1)。运用TALEN技术对斑马鱼bmp8a基因进行敲除。具体方法如下：1)靶位点设计：利用SubmitTALENTargeter(https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen)网站，根据TALEN技术靶位点设计原则，对斑马鱼BMP8a基因每个外显子进行分析，结合zBMP8a基因结构域特点，设计靶位点，并通过NEB公司网站找到高效率酶切位点。选择在第4个外显子上设计靶位点，Spacer为斑马鱼BMP8acDNA的833-849bp，左臂为816-832bp，右臂为850-866bp，Spacer上含有HphⅠ酶切位点，用于后续突变体检验，且HphⅠ酶效率很高，可直接切割PCR产物(图2)。2)靶位点确认在靶位点上下游设计嵌套PCR扩增外侧引物P5和内侧引物P6。以外侧引物P5、基因组粗提液进行第一轮PCR扩增，外侧PCR扩增产物大小为957bp；以内侧引物P6、第一轮PCR产物进行二轮PCR扩增，内侧PCR扩增产物大小为556bp(图3)。HphⅠ酶切内侧PCR产物分别产生227bp、339bp两条带。引物序列如下：P5-F：5'-GGAACTCTGAATCTGCGTCT-3'P5-R：5'-TCACAGGAGGGCGAATAG-3'P6-F：5'-GACAGACATTCAGGCACGTA-3'P6-R：5'-GCCGTCCACTGCTATGAT-3'3)构建TALEN表达载体及体外转录、纯化mRNA利用GoldenGate方法构建TALEN表达载体，并测序。提取含有TALEN表达载体菌液质粒，通过NotⅠ酶将质粒线性化。体外转录合成编码TALEN的mRNA。体外转录结束后，加入1μlDNaseⅠ，37℃水浴孵育15min，以出去mRNA中的DNA模板，并电泳检测。-80℃保存备用。4)显微注射(1)性成熟的野生型斑马鱼雌雄交配产卵，体外受精后收集胚胎。(2)将左臂、右臂TALENmRNA混合，显微注射到单细胞期或2细胞期斑马鱼受精卵中，得到F0胚胎。5)突变检测取2dpf注射后斑马鱼胚胎，粗提基因组。进行嵌套PCR。HPhⅠ酶酶切PCR产物，37℃反应2h。酶切结束后，将10μl酶切产物进行电泳检测。如果有完整的、没有被切开的条带，则靶位点可能发生突变，将未切开的条带回收纯化，回收纯化的PCR产物连接到pGEM-T载体，转化到trans5α克隆菌种，涂布到蓝白斑筛选平板上，挑选出重组子，并测序。将测序结果与野生型BMP8a基因组比对分析，确认基因敲除成功(图4)，获得F0代突变体斑马鱼。6)经过几代的筛选和养殖，获得了在靶位点内缺失7bp的F3代纯合子突变体(图5)。进一步利用Real-timePCR技术检测发现，斑马鱼bmp8a基因敲除后，MHC1基因表达显著下降(图6)。MHCⅠ在提呈病毒抗原给细胞毒性T细胞(cytotoxicTcell，Tc或CTL)的细胞免疫中发挥着关键作用。由此推断Bmp8a蛋白与抗病毒免疫有关。实施例2：GCRV病毒刺激可显著上调斑马鱼bmp8a基因的表达用草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus,GCRV)腹腔注射斑马鱼，分别用Real-timePCR技术检测对脾、肠、肝脏和肾脏组织中bmp8a基因表达的影响，发现GCRV病毒刺激可显著上调斑马鱼bmp8a基因的表达(图7)。同样，用GCRV病毒处理斑马鱼肝脏细胞系(ZFL)，也发现bmp8a基因的表达显著上调(图8)。结果表明斑马鱼bmp8a对病毒刺激有明显的应答反应，Bmp8a在鱼类抗病毒免疫中具有重要作用。实施例3：过表达斑马鱼Bmp8a可显著上调抗病毒相关基因的表达在斑马鱼ZFL细胞系中，过表达斑马鱼B本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Bmp8a蛋白的用途，其特征在于，是在制备提高鱼类抗病毒免疫力的制品中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种Bmp8a蛋白的用途，其特征在于，是在制备提高鱼类抗病毒免疫力的制品中的应用。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制品为饲料添加剂或注射用液体蛋白制剂。3.本发明还提供bmp8a蛋白的另一种用途，是通过检测bmp8a蛋白的表达量来筛选抗病毒能力强的亲鱼。4.如权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘振辉，钟慎杰，王颖，张士璀，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37