一种新型仔稚鱼标本的制作方法技术

本发明专利技术涉及一种新型仔稚鱼标本的制作方法，包括仔稚鱼防腐固定、仔稚鱼脱水、脱水后的仔稚鱼置于饱和硼酸钠中和、加入漂白液中浸制，再置于胰蛋白酶消化液中清洗后加入染色液染色，至骨组织染成紫红色；清水洗去表面染液，置于胰蛋白酶消化液中清洗，一天更换一次至胰蛋白酶消化液清澈；放入梯度透明液中浸泡，完成新型仔稚鱼标本的制。本发明专利技术通过对早期阶段的仔稚鱼采用染色液进行骨骼染色，便于识别鱼类早期阶段的肌节，以实现鱼类仔鱼快速的鉴定。

A New Method for Making Specimens of Larval and Juvenile Fish

【技术实现步骤摘要】
一种新型仔稚鱼标本的制作方法
本专利技术涉及鱼类早期生活史研究领域，尤其是一种新型仔稚鱼标本的制作方法。
技术介绍
鱼类早期资源调查是以处于早期生活史阶段的鱼卵和鱼苗为对象进行资源量调查研究工作，是进行鱼类生态学和保护生物学研究的一项重要手段。通过卵苗采集对早期资源进行调查评估不仅可以了解鱼类繁殖群体的规模和年龄结构变化特征，同时还可以掌握鱼类种群规模的变化趋势和群落动态规律，是渔业资源的开发和利用以及鱼类资源保护的重要依据。鱼类早期发育阶段的种类鉴定即是一项细致而繁琐的工作，也是保证鱼类早期资源调查能够顺利开展的重要基础。传统的鱼类早期资源发育阶段种类鉴定方法，主要以早期发育阶段的鱼类个体形态特征为基础，利用不同种类早期发育阶段在各种可量形状、可数形状及描述性状上的差异进行不同种类的区分。其中可数性状包括鱼类早期发育阶段可以进行直接基数的各种特征，是种类鉴定最重要的鉴定依据之一。因为鱼类从胚胎时期至成鱼均伴随着肌节，仔鱼出膜后肌节数目鱼脊椎骨数目基本相符，不同发育阶段的仔鱼差异不大，是鉴定仔鱼的最有效特征。通常采用两段相加的方式，即躯干和尾部相加的方式。肌节记录采用三段相加的法，即背鳍褶起点前、背鳍褶起点后及肛门拐弯至尾部的纪录法。肌节在鱼类观察阶段不易识别，即使是专业人员也难以快速准确的计数。尤其是早期资源经过防腐液固定后，当下常用的鱼类保存液为95％酒精和福尔马林(10％-40％甲醛)。其中酒精固定后组织脱水，仔稚鱼变形严重，无法进行准确鉴定；福尔马林会引起蛋白质变形，无法观察仔稚鱼肌节等重要特征，因此给早期资源仔鱼的形态学鉴定带来了一定程度的困难。
技术实现思路
鉴于上述现有生产技术的不足，本专利技术提供一种新型仔稚鱼标本的制作方法及应用。本专利技术采用以下技术方案：一种新型仔稚鱼标本的制作方法，包括如下步骤：1)仔稚鱼防腐固定；仔稚鱼体福尔马林中固定；2)仔稚鱼脱水：将固定好的鱼体经过清水漂洗、乙醇脱水；3)脱水后的仔稚鱼置于饱和硼酸钠中和；4)经步骤3)处理后的仔稚鱼加入漂白液中浸制，再置于胰蛋白酶消化液中清洗；5)经步骤4)处理得到的鱼体置于离心管中避光保存，加入染色液染色，至骨组织染成紫红色；6)清水洗去表面染液，置于胰蛋白酶消化液中清洗，一天更换一次至胰蛋白酶消化液清澈；7)经步骤6)处理的鱼体放入梯度透明液中浸泡，完成新型仔稚鱼标本的制。优选地，所述步骤1)仔鱼防腐固定具体操作方法为将仔鱼浸泡在10-15％的福尔马林中2-2.5天。优选地，所述步骤2)仔鱼脱水具体操作方法为将固定好的仔鱼鱼体清水漂洗，45％-55％的乙醇内脱水1-2天，然后95％-98％的乙醇内脱水1-2天。仔稚鱼组织一般均较脆弱，采用逐级脱水方式进行处理，防止发生组织的变质及骨骼扭曲变形等现象。优选地，所述步骤4)漂白液中2.5％-3.5％双氧水(H2O2)和0.5％-1.5％KOH体积比例为3:7，浸制20-40分钟，漂白液置于强光下照射，对仔稚鱼漂白效果最好。优选地，所述步骤4)、6)胰蛋白酶消化液为饱和硼酸钠、水和胰蛋白酶的混合溶液，其中饱和硼酸钠和水按体积比为7：13，胰蛋白酶的浓度为0.1-1g/L，胰蛋白酶消化时间为分解至鱼体的50％-60％，肉眼观察到骨骼轮廓可见即可。其中步骤4加入蛋白酶的量可根据仔稚鱼大小进行调整，如果个体较小可不添加。优选地，所述步骤5)染色液为氢氧化钾：茜红素S：水按质量配比为1:0.001-0.003:100-120的混合溶液，染色条件为：室温下离心机3000-4000r/min染色3-6小时。该步骤完成仔稚鱼的骨骼和肌节染色，其中离心条件下染色较快，效果较好。优选地，所述步骤7)经步骤6)处理的鱼体放入梯度透明液中浸泡中的具体操作为：经步骤6)处理的鱼体放入梯度透明I，每2-3天换一次透明液I至标本沉底；后置于梯度透明液II中，每周换一次透明液II至标本沉底；最终浸泡至纯甘油中，每周换一次甘油；所述梯度透明I为质量比甘油：1％KOH＝3:6-8；所述梯度透明液II为质量比甘油：1％KOH＝6:4-6。该步骤去除仔稚鱼鱼体上的染色液沉积，肌肉逐步变的透明，骨骼和肌节将更好的显现。优选地，仔稚鱼标本在解剖镜下观察肌节，对比不同鱼类肌节表进行种类鉴定。完成记录后加入纯甘油，添加质量比0.01％-0.02％的麝香草酚永久保存。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术通过对早期阶段的仔稚鱼采用染色液进行骨骼染色，便于识别鱼类早期阶段的肌节，以实现鱼类仔鱼快速的鉴定。本专利技术中制作的仔稚鱼形态完整，肌节清晰，可用于鱼类早期阶段种类辨别和鉴定，可用于鱼类早期阶段骨骼发育观察，可用于研究鱼类种群规模的变化趋势和群落动态规律。2、专利技术提供了一种仔稚鱼的鱼体透明、骨骼染色的标本制作方法，针对小型鱼类个体具有操作简单，结果稳定的特点。3、本专利技术可实现一般解剖方法难以观察出的结构，在保持仔鱼标本外形完整的情况下显示出内部骨骼细节。除了肌节外，也可观察肌节、肌间小骨、鳃耙和耳石等组织。4、制备的鱼类肌节标本具有更好的观赏性，同时不易变质，可长久保存。5、脱水后的仔稚鱼置于饱和硼酸钠中和0.5-1天；防止仔稚鱼钙离子流失，茜素红是一种阴离子染料，易与钙离子结合生成红色化合物。该步骤保留了大量的钙离子，更易与染色液中的茜红素S耦合，从而发生显示反应。6、胰蛋白酶消化液为染色前后需要的缓冲液，由饱和硼酸钠、水和胰蛋白酶组成。饱和硼酸钠溶液可防止钙离子变性，保证内部骨骼染色效果。胰蛋白酶溶液可去除浮色，保证肌肉更好的透明。附图说明图1鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)早期生活阶段肌节染色图(24+15)；图2银鮈(Squalidusargentatus)早期生活阶段肌节染色图(22+14)。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步详细的阐述，但本专利技术的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本专利技术，而非用于限制本专利技术的范围。实施例1(1)将培养至1周左右(发育至鳔充气期)的2尾仔鱼防腐固定，浸泡在10-15％的福尔马林中2天；(2)分别将固定好的鱼体标本清水漂洗12-24h，50％的乙醇内脱水1天，然后95％的乙醇内脱水1天；(3)饱和硼酸钠中和0.5天，防止钙离子流失。(4)以质量浓度3％的双氧水(H2O2)漂白1-2小时去除表皮色素，置于胰蛋白酶消化液中清洗，其中胰蛋白酶消化液体积比为饱和硼酸钠：水＝7：13；(5)标本分别置于离心管中避光保存，室温下离心机4000r/min染色3-6小时，至骨组织染成紫红色，染色液质量配比为氢氧化钾：茜红素：水＝1:0.01:100；(6)清水洗去表面染液，置于胰蛋白酶消化液中清洗，一天更换一次至胰蛋白酶消化液清澈，其中胰蛋白酶消化液体积比为饱和硼酸钠：水＝7：13。(7)标本分别放入梯度透明I(质量比甘油：1％KOH＝3:7)，每2天换一次透明液至标本沉底。后置于梯度透明液II(质量比甘油：1％KOH＝6:4)中，每周换一次透明液至标本沉底。最终浸泡至纯甘油中，每周换一次甘油。(8)解剖镜下观察肌节，统计标本肌节分布和数量，根据《长江鱼类早期资》记录，2尾仔鱼分别为鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)(图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型仔稚鱼标本的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：1）仔稚鱼防腐固定；仔稚鱼体福尔马林中固定；2）仔稚鱼脱水：将固定好的鱼体经过清水漂洗、乙醇脱水；3）脱水后的仔稚鱼置于饱和硼酸钠中和；4）经步骤3）处理后的仔稚鱼加入漂白液中浸制，再置于胰蛋白酶消化液中清洗；5）经步骤4）处理得到的鱼体置于离心管中避光保存，加入染色液染色，至骨组织染成紫红色；6）清水洗去表面染液，置于胰蛋白酶消化液中清洗，一天更换一次至消化液无浑浊物出现；7）经步骤6）处理的鱼体放入梯度透明液中浸泡，完成新型仔稚鱼标本的制。

【技术特征摘要】
1.一种新型仔稚鱼标本的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：1）仔稚鱼防腐固定；仔稚鱼体福尔马林中固定；2）仔稚鱼脱水：将固定好的鱼体经过清水漂洗、乙醇脱水；3）脱水后的仔稚鱼置于饱和硼酸钠中和；4）经步骤3）处理后的仔稚鱼加入漂白液中浸制，再置于胰蛋白酶消化液中清洗；5）经步骤4）处理得到的鱼体置于离心管中避光保存，加入染色液染色，至骨组织染成紫红色；6）清水洗去表面染液，置于胰蛋白酶消化液中清洗，一天更换一次至消化液无浑浊物出现；7）经步骤6）处理的鱼体放入梯度透明液中浸泡，完成新型仔稚鱼标本的制。2.根据权利要求1所述的新型仔稚鱼标本的制作方法，其特征在于：所述步骤1）仔稚鱼体长小于80mm。3.根据权利要求1所述的新型仔稚鱼标本的制作方法，其特征在于：所述步骤1）仔鱼防腐固定具体操作方法为将仔鱼浸泡在10-15%的福尔马林中2-2.5天。4.根据权利要求1所述的新型仔稚鱼标本的制作方法，其特征在于：所述步骤2）仔鱼脱水具体操作方法为将固定好的仔鱼鱼体清水漂洗，45%-55%的乙醇内脱水1-2天，然后95%-98%的乙醇内脱水1-2天。5.根据权利要求1所述的新型仔稚鱼标本的制作方法，其特征在于：所述步骤3）脱水后的仔稚鱼置于饱和硼酸钠中和0.5-1天。6.根据权利要求1所述的新型仔稚鱼标本的制作方法，其特征在于：所述步骤4）漂白液中2.5%-3.5%双氧水（H2O2）...

【专利技术属性】
技术研发人员：郜星晨，姜伟，胡亚成，黄安阳，
申请(专利权)人：中国长江三峡集团有限公司中华鲟研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42